Lors du Congres international de Biochimie organisé à Marrakech (Maroc) en Mai 2004, le thème relatif à l'Enzymologie et Metabolisme a connu un grand nombre d'interventions. Les communications émanant principalement de la France et des pays du Maghreb étaient remarquables

Isolement et caractérisation de protéases de bactéries alcalophiles : étude d'une enzyme appartenant à la famille M16 des métalloprotéases.

S. DABONNE, C. MOALLIC, M. DION, J-P. SINE, B. COLAS.

Unité de recherche sur la biocatalyse FRE CNRS 2230, Faculté des Sciences et des Techniques, 2, rue de la Houssinière, BP 92208, 44322 Nantes Cedex 3, soumaila.dabonne@chimbio.univ-nantes.fr / sdabonne@yahoo.fr

Nous avons isolé 59 souches bactériennes à partir de sédiments alcalins du lac Bogoria (30°C; pH 9,0) situé au Kenya. Parmi ces souches, 42 ont pu être identifiées après amplification et séquençage de leur ARN 16 S. Après criblage des activités protéolytiques avec des substrats chromogéniques, et des protéines, nous avons sélectionné une souche (H4) proche de Bacillus halodurans (98% d'homologie) dont le génome est connu. Celui-ci contient un gène codant pour une enzyme appartenant à la famille M16 (métalloprotéases comme par exemple l'insulinase ou la nardilysine) présentant 75% d'homologie avec l'insulinase de Bacillus anthracis. Nous avons amplifié et cloné le gène dans un vecteur d'expression. Le système de surexpression (T7, RNA polymérase) a donné une expression satisfaisante de la protéine recombinante dans E. coli. L'enzyme a été ensuite purifiée en une seule étape par chromatographie d'affinité sur gel Ni-NTA. La caractérisation biochimique et structurale est actuellement en cours et permettra une étude comparative avec les enzymes de la même famille décrites chez les eucaryotes.

Contribution à l'étude de la super oxyde dismutase chez le dromadaire. Caractérisation et purification partielle

A. ESSAMADI1; A. BOUKHANEJER1; A. BAGRI1, B. NASSER1; B. BENCHARKI1.

1 Université HASSAN 1er, Faculté des Sciences et Techniques, Settat, Département de Biologie Appliquée & Agroalimentaire. BP 577, 26000 Settat, Maroc.

L'objectif principal de ce travail est la purification partielle et la caractérisation de la superoxyde dismutase cuivre, zinc dépendante (SOD Cu-Zn) des érythrocytes de dromadaire. La comparaison de cette SOD Cu-Zn avec celle extraite dans un premier temps, des différents organes vitaux de dromadaire (foie, cœur, rein), et dans un deuxième temps, avec celle extraite des sangs d'ovin et de bovin a été également effectuée.
La purification partielle a été procédée par un traitement au chloroforme/ éthanol et une précipitation à l'acétone.
Les résultats d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE-SDS) ont montré que la SOD Cu-Zn du sang de dromadaire possède une masse moléculaire d'environ 31000 Dalton. L'analyse éléctrophorètique a révélé aussi que la protéine est formée de deux sous-unités de masses moléculaires presque identiques, estimées à 16000 Dalton chacune
Le test d'activité au spectrophotomètre a montré que la SOD Cu-Zn des érythrocytes de dromadaire a une activité spécifique de l'ordre de 2500 UI/mg de SOD, cette activité a été mise en évidence et visualisée sur le gel d'éléctrophorése dans les conditions non dénaturantes et à température ambiante en présence du nitrobleu de tetrazolium et de la riboflavine. L'analyse des différentes SOD Cu-Zn, que ce soit du dromadaire ou des autres espèces animales a montré qu'elles ont presque les mêmes caractéristiques. L'analyse de la thérmostabilité de l'activité catalytique a révélé que la SOD Cu-Zn des différents tissus de dromadaire maintient son activité sur le gel éléctrophorètique à une température égale à 100 °C, par contre les activités catalytiques SOD Cu-Zn des autres espèces animales sont sensibles et disparaissent à cette température.

Mots clés : dromadaire, superoxyde dismutase, cuivre, zinc, purification, éléctrophorèse.

Evolution des systèmes d'aminoacylation spécifiques de la tyrosine

L. BONNEFOND1, M. FRUGIER, M. SISSLER, R. GIEGE & J. RUDINGER-THIRION

1 UPR 9002 du CNRS, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 15 rue René Descartes, F-68074 Strasbourg Cedex, France, email : L.Bonnefond@ibmc.u-strasbg.fr

La fidélité de la synthèse protéique est essentielle au bon déroulement de la vie cellulaire. Elle repose d'une part sur la reconnaissance spécifique des codons de l'ARN messager par les anticodons des ARN de transfert (ARNt) au niveau du ribosome, mais également sur la charge spécifique d'un ARNt par son acide aminé homologue. Cette dernière étape est catalysée par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) réparties en deux classes selon la structure de leur site catalytique. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) est particulière parmi les aaRS : bien que présentant les motifs structuraux caractéristiques des aaRS de la classe I, elle se comporte fonctionnellement comme une aaRS de classe II. De plus, son ARNt homologue (ARNtTyr) est le seul dont l'architecture globale change au cours de l'évolution, rendant impossible toute charge croisée entre phylae.
Afin de mieux comprendre l'évolution unique et particulière des ARNtTyr, nous avons entrepris de décrypter les règles spécifiant la tyrosylation l'humain. Pour réaliser ce projet, nous avons synthétisé par une méthode de transcription in vitro les ARNtTyr cytoplasmique et mitochondrial humains, ainsi que les deux aaRS homologues. Tandis que la TyrRS cytoplasmique humaine est connue et étudiée depuis une dizaine d'années, la TyrRS mitochondriale n'était pas annotée dans le génome humain. Nous avons identifié in silico la séquence codante dans une banque de cDNA humain en utilisant les séquences de différentes TyrRS procaryotiques connues comme sondes. La séquence protéique correspondante, après prédiction de son signal d'adressage vers la mitochondrie, a été clonée dans un vecteur d'expression permettant l'ajout de 6 résidus histidine à l'extrémité carboxy-terminale de la protéine. Cette construction permet de purifier aisément l'enzyme par chromatographie d'affinité sur colonne. Disposant des partenaires des deux systèmes de tyrosylation humains, il sera possible de réaliser des tests fonctionnels et de vérifier leurs inter-connexions dans le but de comprendre leur évolution.

Mots clés : ARNtTyr, évolution, mitochondrie humaine, tyrosyl-ARNt synthétase

Identification de la phosphoénolpyruvate carboxylase kinase (PEPC-K) physiologique chez le Sorgho : Mécanisme de photorégulation dans le contexte de la photosynthèse C4.

M. NHIRI & N. BAKRIM

Laboratoire de Biotechnologie, Faculté des Sciences et Techniques, BP 416, 90000 Tanger, Maroc

Chez les plantes C4, la phosphoénolpyruvate carboxylase (EC 4.1.1.31, PEPC) catalyse la fixation photosynthétique du CO2 dans les cellules du mésophylle. Son activité est soumise à un contrôle métabolique par des effecteurs photosynthétiques (L-malate, rétroinhibiteur; glucose 6-P et triose-P, activateurs allostériques), et covalent par phosphorylation d'une sérine du domaine N-terminal (N° 8 chez le Sorgho).
Dans le but de caractériser la PEPC-K responsable de la phosphorylation de la PEPC in vivo, différentes méthodes de purification mises en œuvre dans ce travail distinguent deux types d'activité PEPC-K (Ca2+-dépendant, PEPC-CDPK, et Ca2+-indépendant, BK) dans les extraits protéiques de feuilles de Sorgho illuminées. Selon la technique utilisée, les proportions relatives des deux types de PEPC-K varient, et la CDPK semble être co-purifiée avec la PEPC. D'autre part, l'utilisation de protoplastes des cellules de mésophylle a permis d'établir que la PEPC est phosphorylée in situ par une PEPC-K indépendante du calcium. Ainsi, l'authentification de la PEPC-K physiologique est clarifiée, élément de connaissance fondamental pour comprendre l'organisation, le fonctionnement et la régulation de la chaîne de transduction conduisant à la phosphorylation de la PEPC-C4.
Nous avons étudié les propriétés de la PEPC-C4 in vitro en utilisant la protéine recombinante dans un milieu reconstitué simulant l'environnement de l'enzyme dans le cytoplasme des cellules de mésophylle, et in situ dans le protoplaste. Combinés, la phosphorylation et les effecteurs métaboliques à pH 7,3, augmentent fortement la valeur de l'IC50 pour le L-malate (32 fois), permettant ainsi à l'enzyme de fonctionner en présence de forte concentration en son rétroinhibiteur. Ces métabolites contrôlent également la vitesse de phosphorylation de la PEPC. Ainsi, l'activité de la PEPC-C4 résulterait in vivo de l'interaction réciproque entre les régulations covalente et métabolique.

Mots-clés: Phosphoénolpyruvate carboxylase, Phosphoénolpyruvate carboxylase-kinase, Phosphorylation, Protoplastes, Régulation, Sorgho.

Evolution de l'activité alpha amylase au cours du développement post-embryonnaire chez deux espèces de ravageurs : Plodia interpunctella et Tribolium castaneum

N. GHAILANI, N. BOUAYAD, R. JBILOU, K. AZELMAT, F. SAYAH

Laboratoire de Biologie Appliquée. Faculté des Sciences et Techniques BP 416
Tanger Maroc. E-mail : ghailani_naima@hotmail.com

L'alpha amylase (alpha-1,4-glucan-4-glucanohydrolases, EC 3.2.1.1) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de la liaison alpha-D (1'4) glucan de l'amidon. Elle joue un rôle clé dans le métabolisme des organismes, notamment chez les insectes ravageurs des graines. Ces derniers causent des dégâts énormes aux denrées alimentaires. Ils sont très dépendants de l'activité de l'alpha amylase pour leur survie.
Dans ce travail, nous avons étudié l'évolution de l'activité alpha-amylasique au cours du développement post-embryonnaire chez deux espèces de ravageurs : Plodia interpunctella (Lépidoptères) et Tribolium castaneum (Coléoptères). Cette activité est étudiée chez les larves, les pupes et les adultes. Elle est dosée par spectrophotométrie et révélée après séparation électrophorétique semi-dénaturante sur gel de polyacrylamide.
Les résultats des dosages montrent que pour ces deux espèces, l'activité enzymatique est plus importante chez les larves et très faible chez les pupes. Chez l'adulte de P. interpunctella, l'activité enzymatique est négligeable alors qu'elle reste élevée chez l'adulte de T. castaneum.
Le pattern des zymogrammes montre que :
- chez T. castaneum, il existe une bande majoritaire et une bande minoritaire.
- chez P. interpunctella, nous avons visualisé au moins deux isoenzymes chez les larves et aucune bande n'est observée chez les pupes et les adultes le poids moléculaire apparent de ces isoenzymes est différent chez les deux espèces.
Cette étude préliminaire s'inscrit dans le cadre de lutte biologique contre ces deux ravageurs durant le cycle de développement post-embryonnaire en utilisant des bio-insecticides inhibiteurs de l'alpha amylase.
De ce travail, nous pouvons conclure que les stades larvaires seraient une cible adéquate pour l'action des biopesticides inhibiteurs de l'alpha amylase.

Mots clés : Alpha amylase, insectes, développement post-embryonnaire

Purification et caractérisation de cinq inhibiteurs ovariens de protéases chez le criquet pèlerin, Schistocerca gregaria

S. WATALEB1, A. HAMDAOUI1, B. DEVRREESE2, S-J. CHIOU3, J. VANDEN BROECK3, J. VAN BEEUMEN2, A. DE LOOF3
& L. SCHOOFS3

1Faculty of science Semlalia, Université Cadi Ayyad, B.P. 2390, Marrakech, Morocco, 2 Laboratory for protein Biochemistry and protein Engeneering, RUG, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium, 3Zoological Institute, Katholieke Universiteit Leuven, Naamsestraat 59, B-3000 Leuven, Belgium

Les protéases et les inhibiteurs de protéases des insectes suscitent un intérêt croissant ces dernières années. En effet, ces molécules sont impliquées dans plusieurs processus physiologiques des insectes: processus cyclique de mue, digestion, cascade d'activations protéolytiques de la prophénoloxydase (système immunitaire des insectes).
Chez les criquets ravageurs les rares travaux effectués sur le sujet ont été faits sur Locusta migratoria, notre travail est le premier du genre effectué sur le criquet pèlerin, Schistocerca gregaria.
Cinq inhibiteurs de serine-proteases dénommés SGPI ont été séquencés et étudiés Chez Schistocerca gregaria: SGPI-1 (3816 Da), SGPI-2 (3794 Da) , SGPI-3 (4130 Da),SGPI-4 (4164 Da) et SGPI-5 (4070 Da) Ces inhibiteurs contiennent tous six cystéines impliquées dans trois ponts dissulfures intracatenaires, certains inhibiteurs contiennent une molécule de Fucose. Ces peptides constituent une nouvelle famille très particulière d'inhibiteurs de protéases.
L'action de ces inhibiteurs sur des serine-proteases commerciales différentes (la trypsine bovine, l' -chymotrypsine et l'elastase pancréatique de porc), et sur les proteases de l'insecte nous a révélé des spécificités différentes et une forte sensibilité au niveau du rapport structure-action de ces inhibiteurs.

Mots clés: Criquet pèlerin, Schistocerca gregaria, insectes ravageurs, protéases, inhibiteurs de protéases, lutte anti-acridienne.

Comparaison et caractérisation de la D-ß-hydroxybutyrate déshydrogénase au niveau des mitochondries lourdes et légères du foie de la gerboise (Jaculus orientalis) à différents états physiologiques

D. MOUNTASSIF1, M. KABINE1, N. LATRUFFE2 & M-S. El KEBBAJ1
1 Laboratoire de Biochimie, Faculté des Sciences, Université Hassan II-Aïn Chock, km 8 route d'El Jadida, BP 5366, Casablanca, Maroc, 2 LBMC, Faculté des Sciences, 6 Bd Gabriel, Université de Bourgogne, 21000 Dijon cedex, France.

La D-ß-hydroxybutyrate déshydrogénase (BDH) (EC 1.1.1.30) est une enzyme mitochondriale qui intervient dans l'interconversion des deux principales formes des corps cétoniques, à savoir le ß-hydroxybutyrate et l'acétoacétate. Ces derniers jouent un rôle important dans le métabolisme énergétique et la biosynthèse cellulaire. Le modèle expérimental choisi pour notre étude est la gerboise (Jaculus orientalis) : rongeur hibernant de la famille des dipodidae, vivant dans l'étage semi-aride du Maroc oriental.
Notre travail a consisté à extraire deux types de mitochondries - à savoir les lourdes et les légères - chez la gerboise aux différents états physiologiques (à l'état actif, pré-hibernant et hibernant) et à l'étude des propriétés cinétiques et physico-chimiques de la BDH au niveau de ces mitochondries.
Les résultats obtenus ont montré l'existence des différences significatives entre les deux populations mitochondriales. Ce qui suggère l'existence de deux structures conformationnelles différentes de la BDH, une au niveau des mitochondries lourdes et l'autre au niveau des légères. Ce changement de conformation est dû probablement au changement dans la composition lipidique - déterminé par chromatographie sur couche mince - de la membrane interne des deux mitochondries. Aussi, l'étude de la BDH à différents états physiologiques a montré de grandes différences au niveau de l'expression de la BDH. En effet, en hibernation contrairement à la pré-hibernation, il y a augmentation de l'activité et l'expression protéique de la BDH induisant l'augmentation de la production du taux des corps cétoniques, notamment le ß-hydroxybutyrate utilisé par l'organisme en tant que fournisseur d'énergie pendant cet état de jeûne prolongé.
Tous ces résultats suggèrent d'une part, que la BDH existe en deux états conformationnels, un dans les mitochondries lourdes et l'autre dans les mitochondries légères, et d'autre part, que ces deux BDH subissent une régulation différente selon l'état physiologique.

Mots clés : D-ß-hydroxybutyrate déshydrogénase (BDH), mitochondries lourdes et légères, gerboise (Jaculus orientalis), Hibernation.

Class III PI3K-Beclin-1 complex modulates autophagy in response to amino acid starvation in muscle cells.

A. TASSA, M.P. ROUX & D.M. BECHET.

Unité de Nutrition et de Métabolisme Protéique, INRA UR551, 63122 Ceyrat, France.

Because skeletal muscle constitutes a reservoir of body proteins and amino acids, a major challenge in clinical nutrition is to understand the mechanisms that regulate protein breakdown in this tissue. Amino acid withdrawal strongly increases intracellular proteolysis in differentiated myotubes (C2C12). Using media containing serum but lacking a single amino acid, we identified the amino acids that regulate intracellular proteolysis in differentiated myotubes. Amino acid-dependent regulation of proteolysis in myotubes required active lysosomal endopeptidases and was due to macroautophagy, as indicated by enhanced autophagic sequestration and stimulation of Apg8/LC3 lipidation.
Different signal transduction pathways were previously implicated in the regulation of autophagy in other cell types. Amino acid withdrawal was not associated with major alterations of the phosphorylation status of p38 and ERK1/2 in myotubes. Proteolysis due to amino acid withdrawal was not altered by selective inhibition of these MAPKs, but was prevented by low nanomolar concentrations of wortmannin, which targets classes I, IIß and III of PI3K. Amino acid deprivation, however, did not modify the lipid kinase activity of class I and IIß PI3K. Amino acid deprivation also was not sufficient to alter the Akt/p70S6K pathway. In contrast, amino acid deprivation increased class III PI3K activity, slightly in whole cell homogenates, but strongly in Beclin-1-immunoprecipitates. Stimulation of proteolysis was mimicked by adding micelles of PI(3)P, the class III PI3K product. Inversely, an antibody that inhibits class III PI3K activity reduced proteolysis when transducted into starved myotubes. Because Beclin-1/Apg6 belongs to a multiprotein complex important for autophagic sequestration, our observations support the proposal that amino acid limitation stimulates class III PI3K-Beclin-1 complexes to raise proteolysis in differentiated myotubes.

CONFERENCES & COMMUNICATIONS ORALES

COMMUNICATIONS AFFICHEES

Relationship between the inhibition of phosphatidic acid phosphohydrolase-1 by oleate and oleoyl-CoA ester and its apparent translocation

N. ELABBADI1, A. GAMOUH1, A. ZYAD1 & S.J. YEAMAN2

1Laboratoire d'Immunologie, Biochimie et Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences et Techniques, Université Cadi Ayyad, B.P. 523 Beni-Mellal, Morocco, 2School of Biochemistry and Genetics, Medical School, University of Newcastle upon Tyne, Newcastle upon Tyne NE2 4HH United Kingdom.

In mammalian cells, two forms of phosphatidic acid phosphohydrolase (PAP) activity have been identified (Jamal, 1991). PAP-1 is distributed between the cytosol and endoplasmic reticulum (ER) and is regarded as the metabolic form, involved in the regulation of glycerolipid synthesis. In contrast, PAP-2 is found mainly in the plasma membrane and is thought to be involved in cell-signalling (Waggoner, 1996; Kai, 1997). The metabolic expression of PAP-1 activity is thought to be regulated by the ability of the cytosolic form to translocate to the ER. Largely indirect evidence suggests that this translocation is induced by the accumulation of free fatty acids, acyl-CoA esters and phosphatidic acid (PA) on the ER membranes, resulting in the enhanced synthesis of glycerolipids (Cascales, 1984; Martin-Sanz, 1984; Hopewell, 1985; Tijburg, 1989; Kocsis, 1996). PAP-1 activity is inhibited by Fatty acids and their acyl-CoA esters (Elabbadi et al. (2002) Lipids 37, 69-73) and it appears paradoxical that these effectors have been reported to increase the liver's esterification capacity by translocating the rate-limiting enzyme PAP-1 from cytosol to the endoplasmic reticulum. Therefore, we have examined further the effect of oleate and oleoyl-CoA on the activation and translocation of PAP-1 of rat liver. On the basis of our results, it is proposed that fatty acids and their acyl-CoA esters regulate PAP-1 activity by a mechanism involving negative allosteric interaction, associated with the formation of PAP-1 enzyme-fatty acid complex and resulting in a decreased affinity for its substrate, PA. Such complex (aggregation of PAP-1-fatty acids) can be easily pelleted by centrifugation and may explain the apparent translocation phenomenon of the PAP-1 enzyme to particulate fractions in the presence of fatty acids and/or acyl-CoA esters as reported in many works (Cascales, 1984; Martin-Sanz, 1984; Hopewell, 1985; Tijburg, 1989; Kocsis, 1996). Thus, the re-evaluation of many of the reported factors inducing translocation process of PAP-1 is therefore required. The modulation of PAP-1 activity by the ratio of PA /fatty acids and their acyl-CoA esters, which is in agreement with the metabolism of fatty acids, will be discussed.

References
Cascales, C., Mangiapane, E. H. and Brindley, D. N. (1984), Biochem. J. 219, 911-916.
Elabbadi, N., Day, C. P., Virden, R., and Yeaman, S. J. (2002), Lipids 37, 69-73.
Hopewell, R., Martin-Sanz, P., Martin, A., Saxton, J. and Brindley, D. N., (1985), Biochem. J., 232, 485-491.
Jamal, Z., Martin, A., Gomez-Munoz, A., and Brindley, D. N. (1991), J. Biol. Chem. 266, 2988-2996
Kai, M., Wado, I., Imai, S., Skane, F. And Kanoh, H., (1997), J. Biol. Chem. 272, 24572-24578.
Kocsis, M. G. and Weselake, R. J. (1996), Lipids 31, 785-802.
Martin-Sanz, P., Hopewell, R., and Brindley, D. N. (1984), FEBS Lett. 175, 284-288.
Tijburg, L. B. M., Geelen, M. J. H., and van Golde, L. M. G. (1989), Biochim. Biophys. Acta. 1004, 1-19.
Waggoner, D. W., Gomez-Munoz, A., Dewald, J. and Brindley, D. N. (1996), J. Biol. Chem. 271, 16506-16509.

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