Lors du Congres international de Biochimie organisé à Marrakech (Maroc) en Mai 2004, le thème relatif à la régulation et expression des genes a connu un grand nombre d'interventions. Les communications émanant principalement de la France et des pays du Maghreb étaient remarquables

HIC1, un répresseur transcriptionnel de la famille à domaine BTB/POZ

S. DELTOUR-BALERDI*, N. MARTIN, C. GUERARDEL & D. LEPRINCE

CNRS UMR 8526, Institut de Biologie de Lille, 1 rue Calmette, 59017 Lille Cedex, France.* Adresse actuelle : The Wellcome Trust/Cancer research UK Institute, Tennis court road, Cambridge CB2 1QR, United Kingdom.

Il est maintenant connu que la régulation fine de la transcription par des facteurs de transcription, qu'ils soient activateurs ou répresseurs, nécessite le recrutement de complexes multiprotéiques possédant des activités enzymatiques capables de modifier la structure de la chromatine. Deux types d'activités enzymatiques ont pu être décrites : l'une impliquant le remodelage des nucléosomes et l'autre impliquant les modifications post-traductionnelles des histones.
Notre équipe s'intéresse à un nouveau gène supresseur de tumeur HIC-1 pour Hypermethylated In Cancer. En effet, il est situé en 17p13.3 une région d'ADN génomique hyperméthylée dans certains types de cancers (ovaire, prostate, sein, intestin, poumon) ou délétée dans des cancers de l'ovaire. De plus, des souris hétérozygotes HIC1+/- développent tardivement des tumeurs spontanées. Ce gène code pour un facteur de transcription de la famille BTB/POZ dont le rôle fonctionnel n'était pas encore élucidé. Dans un premier temps, on a pu montrer que HIC-1 est un répresseur transcriptionnel. Cependant contrairement à deux autres protéines de la même famille BTB/POZ, BCL-6 et PLZF qui répriment la transcription en recrutant essentiellement par leur domaine BTB/POZ les co-répresseurs SMRT, mSin3A et HDAC1, on a montré que le domaine BTB/POZ de HIC-1 est incapable d'interagir avec ces protéines. De plus, l'utilisation d'un inhibiteur des HDACs (classe I et II) a montré que ce domaine réprime la transcription sans recruter une activité histone désacétylase. Afin de définir le mécanisme de répression utilisé par le domaine BTB/POZ de HIC-1, on a réalisé un criblage double-hybride pour identifier des partenaires impliqués dans cette activité. Nous avons pu isoler une histone méthyltransférase capable de méthyler la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9 HMTase). Parallèlement, en réalisant un alignement entre les séquences des différentes protéines HIC-1 (humaine, murine, aviaire…), on a pu mettre en évidence dans la région centrale deux motifs peptidiques très conservés : d'une part un site de sumoylation de type FKxE, qui peut être modifié et d'autre part un motif peptidique de type PxDLSxK. Ce motif GLDLSKK permet le recrutement du co-répresseur CtBP. De plus, des expériences de co-transfection transitoire qui utilisent des chimères Gal4 ont montré que cette région centrale est capable de réprimer la transcription indépendamment du domaine BTB/POZ, en recrutant une activité histone désacétylase.
En conclusion, il apparaît donc que HIC-1 est un répresseur qui utilise deux mécanismes distincts pour réprimer la transcription : l'un dépendant d'une activité histone méthyltransférase via son domaine BTB/POZ et l'autre dépendant d'une activité histone désacétylase via sa région centrale.

Etude de aIF2, facteur de démarrage de la traduction chez les archaea

E. SCHMITT , L. YATIME, S. BLANQUET & Y. MECHULAM

Laboratoire de Biochimie, Unité Mixte de Recherche 7654, Ecole Polytechnique-CNRS, F-91128 Palaiseau cedex, France, e-mail: emma@botrytis.polytechnique.fr

La protéine hétérotrimérique e/aIF2 joue un rôle central dans le démarrage de la traduction chez les eucaryotes et chez les archaea. Cette protéine G amène l'ARNt initiateur méthionylé au ribosome et assure la sélection du bon codon de démarrage. Les trois sous-unités de la protéine e/aIF2 de l'archaea Pyrococcus abyssi ont été produites chez Escherichia coli puis purifiées. Des tests d'assemblage montrent que la sous-unité gamma forme le cœur de l'hétérotrimère. La structure tridimensionnelle de la sous-unité gamma a été résolue par cristallographie aux rayons X sous forme libre et sous forme complexée au GDP-Mg2+ ou au GDPNP-Mg2+. La structure d'aIF2 gamma est très homologue à celle des facteurs d'élongation de la traduction du type EF-Tu. Sur la base de cette homologie, de nouvelles implications fonctionnelles concernant le démarrage de la traduction sont proposées. Finalement, la comparaison d'aIF2 gamma et d'EF-Tu a également permis d'identifier les motifs structuraux spécifiques au facteur d'initiation. Ces motifs jouent un rôle dans l'assemblage des sous-unités de l'hétérotrimère.

Mots clés: Démarrage de la traduction, archaea, aIF2, ARN de transfert

Construction d'un modèle de souris knock-out (KO) pour le gène de la thiolase B peroxysomiale (souris thiolase B-/-).

G. CHEVILLARD, M-C. CLEMENCET, N. LATRUFFE & V. NICOLAS-FRANCES

Université de Bourgogne, Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire (GDR-CNRS n°2583), 6 Bd Gabriel, 21000 Dijon, France.

Au niveau du peroxysome, la dégradation des acides gras à très longue chaîne s'effectue par quatre réactions successives catalysées par trois enzymes : l'acyl-CoA oxydase, l'enzyme bifonctionnelle et la 3-cétoacyl-CoA thiolase. Notre équipe, s'intéressant particulièrement à l'activité thiolase, a récemment cloné deux gènes thiolase (A et B) chez la souris. De précédents travaux du laboratoire ont permis de montrer que le gène de la thiolase B était régulé positivement par des activateurs de PPAR (pour Peroxisome Proliferator-Activated Receptor ) et de PPAR . Ainsi, l'objectif de ce travail a consisté à construire un modèle de souris knock-out (KO) pour le gène de la thiolase B afin d'étudier l'impact de l'invalidation de ce gène sur la -oxydation peroxysomiale et plus généralement sur le métabolisme lipidique.
Pour construire ce modèle de souris, il a d'abord fallu cloner le gène de la thiolase B de souris puis construire le vecteur de recombinaison homologue correspondant. Ensuite, ce dernier a été injecté par électroporation dans des cellules souches embryonnaires de souris 129Sv (cellules ES) puis les cellules résistantes à la néomycine et au gancyclovir ont été clonées. 200 clones de cellules ES ont été criblés par PCR afin d'identifier ceux ayant intégré de manière homologue le vecteur de recombinaison. L'un des clones positifs a alors été injecté dans des blastocystes de souris puis réimplantés dans des femelles pseudo-gestantes. Ceci a permis la naissance de souris chimères qui, après croisement avec des femelles sauvages, ont permis l'obtention de souris hétérozygotes thiolase B+/- puis de souris homozygotes thiolase B-/- viables. Sur ces souris KO, diverses expériences sont programmées telles que : des traitements au fénofibrate et à la rosiglitazone (et leurs conséquences sur l'expression des gènes du peroxysome), des courbes de croissance (en fonction du sexe et de l'âge), une analyse de la transmission mendélienne (étude de la fertilité).

Mots clés : recombinaison homologue, cellules ES, thiolase B, transgénèse.

Analyse de l'expression des gènes des interférons a, ß et ? et de leur activité fonctionnelle au cours de la différenciation des adipocytes

W. KHAZEN1, J-P. M'BIKA2, C. TOMKIEWICZ3, A. ACHOUR2, C. CHANY2
& C. FOREST1

1 UMR-S 530 INSERM, Université René Descartes, 2 Laboratoire des interférons et de la sarcolectine, 3 INSERM U490; Centre Univ., 45 rue des Saints-Pères, 75006 Paris,France.

Il est établi qu'en plus de leur fonction de stockage et de libération d'énergie, les adipocytes sont capables de synthétiser et sécréter une série de protéines, parmi lesquelles plusieurs cytokines telles que l'adiponectine, la résistine ou le facteur de nécrose tumorale a. Si quelques études se sont intéressées aux effets des interférons (IFN) sur la différenciation et le métabolisme des adipocytes, la capacité de ces cellules à exprimer les gènes des IFN était restée inexplorée. Nous avons cherché la présence des ARN messagers des IFN béta et gamma, par RT-PCR en temps réel, dans les cellules de la lignée murine 3T3-F442A, au cours de leur différenciation en adipocytes. Les adipoblastes en croissance et les préadipocytes à confluence expriment l'ARNm de l'IFN-ß alors que l'IFN-? n'est pas exprimé à ce stade. Les cellules entament alors un processus de différenciation en adipocytes au cours duquel les ARNm de l'IFN-ß et de l'IFN-? ne sont pas détectables. En revanche, à un stade très tardif de maturation en adipocytes (12 jours après la confluence; J12), l'ARNm de l'IFN-? s'exprime. Nous avons alors testé l'activité biologique des IFN des adipoblastes, des préadipocytes et des adipocytes à différents stades de différenciation à l'aide de 2 tests. L'un concerne la capacité du milieu de culture conditionné pendant 48 heures, à prévenir l'infection de cellules MDBK, très sensibles aux IFN a, par le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV). L'autre a trait à la résistance des cellules 3T3-F442A à l'infection virale due au VSV, par l'IFN contenu dans le milieu conditionné par ces mêmes cellules. Le milieu conditionné par les adipoblastes et les préadipocytes exerce un effet antiviral, suggérant fortement la présence d'IFN dans ce milieu, en accord avec l'expression de l'ARNm IFNß à ce stade. En revanche, le milieu conditionné par les adipocytes à J12 et au delà, ne présente pas d'activité antivirale sur les cellules MDBK, ce qui peux laisser supposer que ces dernières n'expriment pas le récepteur de l'IFN-? et donc y sont insensibles. Cette hypothèse est confortée par le fait qu'une activité antivirale, vraisemblablement due à la présence de l'IFN-?, existe dans le milieu conditionné par les adipocytes à J12 et au delà, puisque celui-ci permet la résistance de ces mêmes adipocytes à l'infection par le VSV. Ces cellules expriment donc aussi vraisemblablement le récepteur de l'IFN?. Ainsi, nous mettons en évidence pour la première fois la présence des IFN ß et ? dans les cellules 3T3-F442A et leur expression différentielle au cours de la différenciation adipocytaire. Leur rôle dans ce processus reste à déterminer.

Mots clefs : adipocyte, interféron, différenciation, infection virale

L'effet de la mutation au niveau du gène SeqA et dam sur le métabolisme lipidique chez E.coli

D. DAGHFOUS, A. CHATTI &, A. LANDOULS

Faculté des sciences de Bizerte, Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, Zarzouna 7021 Bizerte, Tunisie. E-mail : douraid_2001@yahoo.fr

Il est bien établi que la régulation négative de l'initiation de la réplication chez E.coli est assurée par la séquestration membranaire de l'origine de réplication à l'état hémiméthylé. Cette régulation assure que chaque copie de l'origine de réplication subie une seule initiation et une seule par cycle cellulaire. La protéine SeqA a été identifiée comme étant directement impliquée dans cette séquestration. Ceci nous a incité à chercher si cette protéine a un rôle au niveau de la structure et la fonction de la membrane bactérienne.
Après l'extraction de la membrane bactérienne par la technique de Bligh et Dyer (1959), nous avons analysé les taux des lipides membranaires par chromatographie en phase gazeuse (CPG) des souches isogéniques : C600, C600SeqA-, C600dam13 et C600SeqA-dam-. Les résultats obtenus montrent une très forte perturbation au niveau du métabolisme lipidique chez le mutant C600SeqA- et C600dam13. Nous avons remarqué aussi l'apparition de nouveaux intermédiaires métaboliques avec des chaînes carbonées longues tel que C20:0 et C22:0. Chez le double mutant C600SeqA-dam-, nous avons obtenu un rétablissement du métabolisme lipidique.
Nous suggérons l'existence d'un effet antagoniste des deux protéines SeqA et dam sur le métabolisme lipidique chez E.coli soit directement au niveau de la chaîne enzymatique intervenant dans ce métabolisme, soit indirectement en intervenant au niveau de la régulation de l'activité de ces enzymes.

Modélisation moléculaire des mutations du récepteur des lipoprotéines de faible densité impliqué dans l'hypercholestérolémie familiale au Maroc

A. KETTANI1, Q. YMLAHI1, R. CHATER1 , K. AIT CHIHAB1, S. MOUSSAMIH3, F. BENNIS2, A. ADLOUNI1, K. ZAKREWSKA5, R. LAVERY5, D. PERAHIA4, M. El. MESSAL2

1Laboratoire de Recherche sur les Lipoprotéines, Faculté des Sciences Ben M'sik, Casablanca, Maroc, 2Laboratoire de Biochimie, Faculté des Sciences Aïn Chock, Casablanca, Maroc, 3Service de pharmacologie, Faculté de médecine, Casablanca, Maroc, 4Laboratoire de Modélisation et d'Ingénierie des Protéines IBBMC, Université Paris-Sud, Orsay, France, 5Laboratoire de Biochimie Théorique, Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris 5, France. Email : anasskettani@hotmail.com

Le récepteur des lipoprotéines de faible densité (RLDL) est une glycoprotéine membranaire de 839 acides aminés, responsable de l'épuration du cholestérol des LDL plasmatiques (C-LDL). Des mutations au niveau du gène codant pour le RLDL causent un dérèglement de cette fonction, et sont à l'origine d'une hyperlipidémie primaire d'ordre génétique : l'hypercholestérolémie familiale (HF). Une étude moléculaire récente de cette maladie, chez la population marocaine, a permis de classer certaines mutations responsables de l'expression du phénotype HF. L'analyse moléculaire du gène du RLDL a été réalisée par amplification génique des différents exons par PCR (Polymerase Chain Reaction), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) et séquençage. Parmi les mutations identifiées, on distingue 4 mutations ponctuelles touchant les exons 4, 6, et 14 : C113R, G266C, P664L et C690S, respectivement (M. El Messal et al, 2003). Ces variations affectent la structure de deux domaines du récepteur indispensables pour son fonctionnement : domaine de fixation et domaine d'homologie avec l'EGF. Le recours à la modélisation moléculaire a permis dans un premier travail de faire des calculs de minimisation d'énergie et de dynamique moléculaire sur la structure 1N7D du récepteur déterminée par radiocristallographie (Rudenko et al., 2002) décrivant toute la partie extra cellulaire soit une séquence de 699 acides aminés. Tous les calculs ont été réalisés à l'aide des programmes CHARMM (Brooks et al., 1983) exécutés sur machines pentium IV sous un environnement linux. L'analyse des trajectoires de 500 picosecondes de dynamique moléculaire sur le récepteur sauvage et les mutants C113R, G266C, P664L a permis de mettre en évidence la flexibilité des acides aminés observant un déplacement supérieur à 5 Å. Ces premiers résultats confirment un comportement dynamique différent selon mutations observées. Nous avons ici une ébauche d'explication du défaut d'activité du récepteur muté. Des expériences de biologie moléculaire sur d'autres familles HF au Maroc sont en cours pour rechercher de nouvelles mutations.

Mots clés : Hypercholestérolémie Familiale (HF), Récepteur des lipoprotéines de faible densité (RLDL), Mutation, Modélisation Moléculaire, CHARMM

L. JANIERE, R. LESTINI, C. SUSKI, E. LE CHATELIER, M. TITOK,
B. DALMAIS, J. CHAPUIS, D. CANACEILL & S. DUSKO EHRLICH.

Laboratoire de génétique Microbienne, INRA, 78350 Jouy en Josas, France.

La réplication de l'ADN est un processus biologique ubiquitaire parfaitement coordonné avec le cycle cellulaire afin d'assurer une distribution optimale du matériel génétique dans les cellules filles au moment de la division. Il est bien établi que cette coordination s'exerce principalement par le contrôle de l'initiation de la réplication. Par contre, et de façon surprenante, aucun système de régulation de la phase d'élongation n'a été décrit jusqu'à ce jour (à l'exclusion des systèmes répondant à la présence de lésions dans l'ADN). Cependant, cette phase de la réplication est probablement régulée puisque, chez la bactérie Escherichia coli, le temps nécessaire pour répliquer le chromosome varie en fonction de la richesse du milieu environnant. Il est de 40mn en milieux riches et augmente progressivement pour atteindre plus de 250 mn en milieux pauvres. Ceci suggère que la vitesse de la fourche de réplication varie en fonction du métabolisme cellulaire de 1000 à moins de 200 nucléotides par seconde. Le(s) mécanisme responsable de cette régulation est inconnu. Il ne semble néanmoins pas dépendre d'une variation du pool de nucléotides, briques nécessaires à la synthèse d'ADN, au moins dans les milieux riches et modérément riches.
Nous présentons ici une étude génétique qui relie la phase d'élongation de la synthèse d'ADN au métabolisme central de carbone chez la bactérie Bacillus subtilis. En effet, nous avons observé que des mutations thermosensibles (Ts) affectant certains gènes de la phase d'élongation de la réplication sont efficacement supprimées par des mutations réduisant fortement l'activité d'enzymes glycolytiques. Ce phénomène semble impliquer un processus spécifique puisque (i) seulement 5 des 20 gènes du métabolisme central de carbone testés peuvent exprimer un pouvoir suppresseur, (ii) lorsqu'une protéine de réplication répond à une mutation glycolytique, toutes les mutations Ts de cette protéine sont supprimées et (iii) chaque mutation glycolytique a un spectre de suppression qui lui est propre. Par ailleurs, la suppression ne semble pas due à une réponse de type stress, un ralentissement de croissance, un déséquilibre du pool de métabolites et à une sur-expression des protéines supprimées. De plus, les protéines Ts sont toujours essentielles à la synthèse d'ADN dans les souches supprimées. Ainsi, on postule qu'il existe un lien fonctionnel entre le métabolisme central carboné et la fourche de réplication en cours d'élongation chez B. subtilis. Nous proposons que ce lien, qui pourrait être un des éléments impliqués dans la modulation de la vitesse de la fourche de réplication en fonction du métabolisme cellulaire, est ubiquitaire et qu'il pourrait apporté des éclaircissements sur certains cancers dont l'une des causes primaires est l'apparition de mutations dans des gènes du métabolisme central de carbone.

Mot clefs : Réplication d'ADN ; Glycolyse ; Bacillus subtilis

CONFERENCES & COMMUNICATIONS ORALES

COMMUNICATIONS AFFICHEES

PROGRAMME ......... Accueil

CONGRES SMBBM 2009 ... CONGRES SMBBM 2006 ... WORKSHOP BIOTECH 2005 ... CARAVANE-BIOCHIMIE 2005-07 ... CONGRES SMBBM 2004 ... LIENS-ECHANGES ... CONGRES-ANNONCES... CONFERENCES-ANNONCES ... WORKSHOPS-ANNONCES ...