Lors du Congres international de Biochimie organisé à Marrakech (Maroc) en Mai 2004, le thème relatif à la Biochimie et Santé a connu un grand nombre d'interventions. Les communications émanant principalement de la France et des pays du Maghreb étaient remarquables

Etude des relations structure-fonctions d'une glycoprotéine multifonctionnelle impliquée dans la défense de l'organisme : la lactoferrine.

D. LEGRAND
Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle - UMR 8576 du CNRS - Université des Sciences et Technologies de Lille 1 - IFR 118 - Bâtiment C9 - 59655 Villeneuve d'Ascq cedex, France. E-Mail : dominique.legrand@univ-lille1.fr

Récemment, le séquençage du génome humain a mis en évidence le fait que le nombre de gènes est très nettement inférieur au nombre de fonctions nécessaires à la vie, la défense et la communication des cellules. Ce constat a mis en exergue, non seulement l'importance des modifications post-traductionnelles, mais également l'évidence selon laquelle une même protéine peut remplir de nombreuses et différentes fonctions. La lactoferrine (Lf) est clairement l'une d'entre-elles au service de la défense de l'organisme.
Isolée du lait de femme par Jean Montreuil dans le laboratoire, la Lf a d'abord pris le nom de " lactotransferrine ", une appellation qui supposait la présence dans le lait d'un simple variant de la transferrine sérique. Par la suite, la Lf a été retrouvée dans la plupart des sécrétions et dans les granules secondaires des neutrophiles. S'il est vrai, comme l'ont montré nos travaux, que la Lf possède une structure très homologue à celle de la transferrine, il est vite apparu que la fonction de cette molécule n'est pas celle d'un simple transporteur du fer dans les tissus et les sécrétions. La Lf est une glycoprotéine de 80 kDa, monocaténaire et bilobée, capable de fixer 2 Fe3+ avec une stabilité extrême à pH physiologique. Cette capacité lui permet de rentrer en compétition avec les sidérophores bactériens, exercant ainsi une activité bactériostatique, et de prévenir la formation de radicaux libres générés par le fer libre. En fait, l'activité anti-infectieuse de la Lf ne se limite pas à cette propriété de fixation du fer car elle est également capable d'une activité bactéricide par interaction directe avec les microorganismes. Une partie importante de nos travaux a été consacrée à la recherche du mode d'action de la Lf dans ces phénomènes et nous avons pu caractériser les motifs structuraux de la molécule responsables de cette activité et leurs interactions avec les cibles cellulaires, en particulier les lipopolysaccharides (LPS) et les porines bactériennes. La découverte de ces motifs structuraux a été riche en enseignements sur les mécanismes par lesquels la Lf exerce des activités aussi diverses et importantes que l'activité anti-virale, la modulation des réponses inflammatoire et immune, et un effet inhibiteur de la prolifération des cellules cancéreuses. Nous avons pu ainsi identifier de nombreuses cibles moléculaires de la Lf, solubles (endotoxines et leur récepteur, le CD14) ou à la surface cellulaire (protéoglycannes, récepteurs protéiques), caractériser les interactions et le devenir des complexes et, dans certains cas, les mécanismes d'action préçis. La découverte récente d'un ligand de la Lf, la nucléoline, une protéine nucléolaire réalisant la navette entre le noyau et la surface des cellules en division, donne corps aux mécanismes d'internalisation et de ciblage nucléaire de la Lf observés dans les cellules cancéreuses conduisant à l'inhibition de leur prolifération. Dans cet exposé, je décrirai ma contribution à l'étude des relations structure-fonctions de cette fascinante molécule désormais largement utilisée, native ou sous forme de peptides dérivés, comme alicament ou en cosmétologie.
Mots-clés : lactoferrine, transferrine, fer, infection, cancer, inflammation.

Protéolyse Ca2+-dépendante et migration cellulaire : aspects moléculaires

G. MAZERES, S. DEDIEU, S. DULONG, A. DUCASTAING, J.J. BRUSTIS,
S. POUSSARD, P. COTTIN

Université Bordeaux 1, Laboratoire. Biosciences de l'Aliment, ISTAB, USC-INRA 429, Av. des Facultés, 33405 Talence, France. E-mails : g.mazeres@istab.u-bordeaux1.fr, dedieustef@yahoo.fr, s.dulong@istab.u-bordeaux1.fr, a.ducastaing@istab.u-bordeaux1.fr, brustis@tpbcm.u-bordeaux.fr, s.poussard@istab.u-bordeaux1.fr, p.cottin@istab.u-bordeaux1.fr

Les calpaïnes, protéases neutres Ca2+-dépendantes, sont largement exprimées dans les différents tissus des mammifères. Ces enzymes sont impliquées dans de nombreux phénomènes physiologiques et pathologiques comme la prolifération cellulaire, l'apoptose, la dissémination métastasique, les dystrophies, la migration et la différenciation cellulaire. Ce travail fait état des études effectuées sur la capacité de ces protéases à réguler la migration des cellules musculaires (les myoblastes), étape cruciale, permettant à ces cellules de s'aligner afin de fusionner. Pour ce faire, des constructions plasmidiques ont été réalisées et ont conduit par transfections stables à l'obtention de lignées cellulaires (C2C12) sur-exprimant un inhibiteur protéique spécifique des calpaïnes : la calpastatine. Les résultats obtenus mettent en évidence une incapacité totale des cellules tranfectées à migrer. Par ailleurs, ces cellules présentent une morphologie anormalement arrondie, une absence de protusion membranaire: une désorganisation du réseau d'actine (fibres de stress) est aussi observée. Suite à l'inhibition de la protéolyse Ca2+-dépendante, les myoblastes présentent une inhibition importante de leurs cinétiques d'adhésion correspondant très probablement au manque de formation des plaques focales. Au niveau moléculaire, une recherche des substrats potentiels des calpaïnes a été réalisée : parmi ceux connus comme étant des substrats in vitro, desmine, ezrin, radixin, moesin, taline, vinculine, seule une accumulation de la protéine MARCKS (Myristoylated Alanine Rich C Kinase) a été observée dans les clones sur-exprimant la calpastatine. Des résultats analogues ont été obtenus suite à l'inhibition de la protéolyse Ca2+-dépendante par des inhibiteurs chimiques (calpaïne-inhibiteur 2, calpeptin). Afin de confirmer les résultats précédents, des lignées cellulaires (C2C12) sur-exprimant MARCKS (wild type) ont été utilisées. Comme attendu, les résultats obtenus montrent une inhibition très significative de l'activité migratoire. Des expérimentations supplémentaires ont été réalisées : elles avaient pour but de déterminer l'importance de la phosphorylation et de la localisation de MARCKS lors des phénomènes migratoires. En effet, MARCKS, en fonction de son degré de phosphorylation et de myristoylation est soit membranaire, soit cytosolique. L'utilisation d'un activateur des protéines kinase C (le phorbol myristate acétate), confirme que l'inhibition de la migration des myoblastes est due à une accumulation de MARCKS au niveau membranaire, le taux de cette protéine étant régulé par la protéolyse Ca2+-dépendante.

Mots clés : calpaïnes, calpastatine, migration cellulaire, MARCKS

Comparative study of chemical composing, anti-bacterial, anti-fungal and anti-tumoral activities of essential oils from eleven species of Moroccan thyme

A. JAAFARI1, L. AIT MBAREK1, Y. OUHADDOUCH2, A. BENHARREF3, A. BOULLI4, A. ABBAD5, N. ELABBADI1, A. GAMOUH1, R. ABOUFATIMA6, M. KAMAL 1, M. BENSALAH1, A. CHAIT 6, A. DALAL6, & A. ZYAD1

1Laboratoire d'Immunologie, Biochimie et Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences et Techniques, BP. 523 , 23000 Béni-Mellal, Morocco, 2Laboratoire de Microbiologie, Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech, Morocco , 3Laboratoire de chimie organique et hétérocycles, Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech, Morocco, 4Laboratoire d'analyse et valorisation des ressources environnementales, 5Laboratoire d'écologie végétale, Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech, Morocco, 6Laboratoire d'Ecophysiologie, Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech, Morocco

Actually, there is a worldwide interest in the role of natural drugs in complementary medicine. We have performed a comparative study of eleven species of Thymus, a plant highly used in the treatment of a wide spectrum of diseases in Morocco. Such study interested the chemical composing of essential oils, their antibacterial and antifungal activities as well as the in vitro cytotoxicity against a large panel of tumor cells followed by the in vivo validation of these observations. These essential oils have been extracted using hydro distillation technique. The GPC-Masse spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analysis of these natural extracts indicate that the eleven species can be divided to three different groups according to their chemical compounds. Furthermore, the microbiological tests revealed a high antibacterial and anti fungal activity of these essential oils against a different strains although a variability between species was observed. On the other hand, the essential oil of Thymus broussonettii was evaluated for its cytotoxic activity against different cancer cell lines. Our results indicate that this extract shows an in vitro cell killing against the mastocytoma P-815 cell line as well as other carcinoma cells. These in vitro observations were validated in vivo using the DBA-2/P815 model. Furthermore, a comparative study between the eleven species of thyme (Thymus) with respect to their antitumor, anti metastatic effects are undertaken in our laboratory. The molecular mechanisms involved in these activities are also under study. These observations with respect to apoptosis and angiogenesis will be discussed.

Inflammation et dyslipidémies: Prédicteurs du risque cardiovasculaire chez les hémodialysés

H. LAHRACH1, H. LEBRAZI1, N. GHALIM2, S. LAKHDAR1, N. KHANFRI3, B. RAMDANI3, D. ZAID3 & R. SAILE1.

1Laboratoire de Recherche sur les Lipoprotéines, Université Hassan II-Mohammédia, Faculté des sciences Ben M'sik, Casablanca, 2Laboratoire de Biochimie, Institut Pasteur du Maroc, Casablanca, 3Service de Néphrologie et d'Hémodialyse, CHU Ibn Rochd, Casablanca, Maroc.

Les complications cardiovasculaires liées à l'athérosclérose constituent la première cause de décès chez les insuffisants rénaux chroniques (IRC) traités par hémodialyse. L'IRC est habituellement accompagnée par des anomalies métaboliques sévères surtout les anomalies du métabolisme lipoprotéinique et l'inflammation qui augmentent le risque d'athérosclérose.
Dans ce travail, on a déterminé chez 84 patients hémodialysés, les lipides (CT, TG, HDL-C et LDL-C), les apolipoprotéines (apoAI, apoB et apoE), les particules lipoprotéiniques (LpAI, LpAI:AII et Lp(a)) et deux marqueurs sensibles de l'inflammation (Protéine C-réactive (CRP) et apolipoprotéine sérique amyloïde A (apoSAA)). En comparaison avec les sujets sains (n=84), les hémodialysés présentent une hypertriglycéridémie (p<0,001), une augmentation de la concentration sérique du LDL-C (p<0,01) et une diminution du HDL-C (p<0,001), alors que le cholestérol total reste inchangé. Nous avons également observé une augmentation de la concentration de l'apoB (p<0,05) et de la Lp(a) (p<0,001), et une diminution de l'apoAI (p<0,001), l'apoE (p<0,001), LpAI (p<0,01) et de la LpAI:AII (p<0,001). En parallèle, une augmentation des concentrations sériques des protéines inflammatoires (CRP et apoSAA) a été observée respectivement chez 33% et 45% des patients, en l'absence d'infection cliniquement apparente : chez ces patients, une diminution nette du HDL-C et de la serum albumine a été observée. Durant cette étude effectuée sur une période de deux ans, 11 patients (13,1%) ont décédé. Cette mortalité a été principalement d'origine cardiovasculaire. L'analyse statistique univariée a montré que de nombreux facteurs ont été significativement associés à la mortalité globale et cardiovasculaire à savoir: l'âge, CRP, apoSAA, LDL-C et Lp(a).
L'inflammation et les dyslipidémies sont donc des prédicteurs indépendants du risque cardiovasculaire et de la mortalité chez les insuffisants rénaux chroniques sous hémodialyse. La compréhension des mécanismes de ces anomalies pourrait contribuer au développement des stratégies de prévention et du traitement efficace.

Mots clés : Inflammation, profil lipoprotéinique, hémodialyse, athérosclérose, mortalité.

Phosphorylation des protéines et pouvoir pathogène de Staphylococcus aureus

D. SOULAT, E. VAGANAY, C. GRANGEASSE, A. J. COZZONE, B. DUCLOS

Institut de Biologie et Chimie des Protéines, UMR 5086, Université C. Bernard Lyon1 - CNRS, 7, passage du Vercors, 69367 Lyon Cedex 07, France.E-mail : d.soulat@ibcp.fr

La phosphorylation des protéines est une modification post-traductionnelle réversible. Chez les microorganismes, cette modification a surtout été étudiée, à ce jour, dans les bactéries à Gram-négatif, notamment Acinetobacter johnsonii et Escherichia coli, ou un couple de protéines homologues, une protéine-tyrosine kinase et une phosphotyrosine-protéine phosphatase, ont été mises en évidence.
Nous avons récemment étudié la réaction de phosphorylation chez Staphylococcus aureus qui est, elle, une bactérie à Gram-positif, responsable d'infections nosocomiales sévères. Nous avons caractérisé deux phosphotyrosine-protéine phosphatases et montré que ces enzymes sont capables de déphosphoryler spécifiquement la phosphotyrosine.
Nous avons également détecté deux activités protéine-tyrosine kinases dont l'une est portée par une protéine impliquée dans la biosynthèse de la capsule. L'étude de ces activités kinases montre une différenciation dans les mécanismes d'activation des kinases issues des bactéries à Gram-négatif et celles de S. aureus. De plus, au vu d'une forte homologie entre ces kinases et différentes ATPase, nous avons prolongé étudié l'activité ATPase de ces protéines. Le but de cette étude est de comprendre le rôle de ces protéines dans la biosynthèse de la capsule.
La capsule étant connue comme un facteur de virulence important chez S. aureus, une relation entre la phosphorylation des protéines et la pathogénie des bactéries peut être envisagée.

Mots clés : Capsule, Protéine-tyrosine kinase, Phosphotyrosine-protéine phosphatase, ATPAse, Staphylococcus aureus

Soulat D, Vaganay E, Duclos B, Genestier AL, Etienne J & Cozzone AJ., J. Bacteriol. (2002); 184(18):5194-9.

Effet de la déplétion tissulaire en L-carnitine sur le métabolisme énergétique et la fonction contractile du myocarde de rat.

A. GUENDOUZ1 , Z. EL ALAOUI TALIBI1, J. NZONZI2 & J. MORAVEC2

1Département de Biologie, Université Caddi Ayad, Faculté des Sciences et Techniques, Marrakech, Maroc, 2Département de Physiologie, Université Claude Bernard-Lyon I, 69622 Villeurbanne, France. E-mails: guendouz@fstg-marrakech.ac.ma, talibiz@fstg-marrakech.ac.ma, moravec@wanadoo.fr

La déplétion tissulaire en L-carnitine est souvent associée aux altérations du métabolisme lipidique et aux troubles contractiles du myocarde hypertrophié. Afin d'étudier l'impact d'une telle déficience en L-carnitine sur les plans biochimiques et physiologiques du myocarde, nous avons adopté un modèle expérimental visant à dépléter les cœurs de rats femelles adultes en L-carnitine par injection intraperitonéale en D-carnitine. A la fin de traitement, les cœurs de ces rats sont isolés et perfusés en présence du palmitate (1.2 mM), du glucose (11 mM) selon la méthode de Neely. Les vitesses des différentes voies métaboliques sont mesurées à l'aide des méthodes isotopiques. Les taux tissulaires de la carnitine et ses dérivés estérifiés sont déterminés par des méthodes radioisotopiques.
Les taux tissulaires de la L-carnitine et ses dérivés estérifiés sont significativement abaissés chez ces cœurs traités à la D-carnitine. La déplétion en L-carnitine est accompagnée d'une augmentation significative des taux tissulaires des acyl-CoA à longues chaînes. Cette déficience en L-carnitine entraîne un ralentissement de l'utilisation des acides gras à longues chaînes sans que les performances mécaniques ne soient sérieusement perturbées. La préservation de la contractilité du myocarde traité semble être le résultat d'une meilleure contribution de l'oxydation glucidique au métabolisme énergétique qui passe de 14 % à 30 %. Les rapports ATP/ADP.Pi et NAD+/NADH,H+ restent inchangés. Ceci suggère le bon approvisionnement de la chaîne respiratoire en équivalents réducteurs.
Ce traitement à la D-carnitine se traduit par une déplétion importante en L-carnitine non associée à une dépression de la contractilité. Le myocarde s'adapte probablement à un nouvel équilibre métabolique capable de stabiliser ces performances cardiaques. Cette période d'adaptation sera suivie sans doute par une période de décompensation, similaire à celle décelée chez les cœurs hypertrophiés défaillants suite à l'accumulation des acyls-CoA à longues chaînes responsable de l'inhibition d'un certain nombre d'enzymes clés du métabolisme énergétique.

Mots clés : L-carnitine, myocarde, contrôle énergétique, fonction contractile, métabolisme intermédiaire.

CONFERENCES & COMMUNICATIONS ORALES

COMMUNICATIONS AFFICHEES

Interaction de HasAsm avec ses partenaires : l'hème et HasRsm

C. CAILLET1, N. IZADI-PRUNEYRE1, C. WANDERSMANN2, M. DELEPIERRE & A. LECROISEY1

Institut Pasteur,1Unité de RMN des Biomolécules - URA 2185, 2 Unité des membranes bactériennes, CNRS URA 2172, 25-28 rue du Docteur ROUX - 75015 Paris

Chez les bactéries, le fer est un nutriment essentiel. Or dans les milieux biologiques, il se retrouve principalement sous deux formes : l'état ferrique Fe3+, quasi insoluble, et l'état ferreux Fe2+, toxique pour les cellules. Les bactéries ont donc développé de puissants systèmes d'acquisition du fer, dont celui des hémophores, petites protéines qu'elles sécrètent via un transporteur ABC. Les hémophores ont pour rôle de capturer l'hème, libre ou lié à des hémoprotéines comme l'hémoglobine, et de le délivrer à un récepteur de la membrane externe TonB-dépendant.
Notre étude porte sur l'hémophore HasAsm (pour "Heme Acquisition System A"). Cette protéine de 19 kDa est sécrétée en conditions de carence en fer par l'entérobactérie Serratia marcescens, un pathogène opportuniste. HasAsm capte l'hème avec une stoechiométrie de un et une très forte affinité (Ka=5x1010 M-1). L'hème de l'holoHasAsm est porté par deux boucles. Son fer est sous forme ferrique paramagnétique et lié à la protéine par un couple inhabituel de résidus, histidine/tyrosine.
HasAsm a été caractérisée par une variété d'approche; cependant, les mécanismes de capture et de délivrance de l'hème à son récepteur HasRsm restent encore inconnus. Nous avons mis en évidence que l'hème est présent sous deux formes dans le site de fixation, chaque forme montrant un équilibre de spin 1/2 - 5/2. Cet équilibre indique une modification de l'environnement de l'hème, notamment au niveau des ligands axiaux: remplacement par un autre résidu, un ion hydroxyle ou une molécule d'eau; variation des angles et/ou de la longueur des liaisons. L'étude de l'hème dans son site de fixation est entreprise par RMN.
Parallèlement à cette étude, le récepteur HasRsm a été surexprimé et purifié. Son interaction avec HasAsm, chargée ou non, sera analysée par RMN, par la technique de transfert de saturation qui permet d'identifier les zones d'interaction entre deux protéines. La faisabilité de cette étude nécessite que l'une des deux protéines soit marquée à l'azote 15 et deutérée. Nous avons mis au point une méthode de deutération de HasAsm permettant d'obtenir des quantités de protéine stable, suffisantes pour une étude par RMN.
L'étude de l'interaction HasRsm-HasAsm sera étendue à celle du complexe avec la protéine TonB.

Mots-clés : hémophore, RMN, récepteur membranaire, deutération, interaction protéine-protéine

Etude de la protéine TgDRE, une enzyme de réparation de l'ADN exprimée par le parasite Toxoplasma gondii

K. FRENAL1, K. WECKER1, N. DENDOUGA2, I. CALLEBAUT3, M. DELEPIERRE1, S. TOMAVO2, N. WOLFF1

1 Unité de Résonance Magnétique Nucléaire des Biomolécules, Institut Pasteur, CNRS URA 2185, 28 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, 2 Equipe de Parasitologie Moléculaire, Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, CNRS UMR 8576, Université des Sciences et Technologies de Lille, 59655 Villeneuve d'Ascq, France, 3 Laboratoire de Minéralogie-Cristallographie de Paris, CNRS UMR 7590, 4 Place Jussieu, 75252 Paris Cedex 05, France.

Toxoplasma gondii est un parasite pathogène opportuniste, intracellulaire obligatoire, appartenant au même phylum que le Plasmodium falciparum et responsable de la toxoplasmose chez l'homme. Son infection est asymptomatique et bénigne la plupart du temps cependant elle se révèle dangereuse en cas de toxoplasmose congénitale ou chez les personnes immunodéprimées (cancer, sida, greffe) chez lesquelles elle peut causer la mort par encéphalite.
Ce parasite existe sous deux formes : une forme virulente à division rapide et une forme latente qui peut persister à vie enkystée au sein de l'hôte. Alors que des traitements existent pour la forme virulente, aucun n'existe pour la forme kystique d'où l'importance de comprendre les mécanismes intervenant dans l'interconversion du parasite. Plusieurs protéines ont ainsi été mises en évidence (Yahiaoui et al., 1999) pour leur expression différentielle selon le stade parasitaire. L'une d'entre elles a été identifiée comme une enzyme de réparation de l'ADN (Dendouga et al., 2002) et nommée TgDRE (Toxoplasma gondii DNA Repair Enzyme). Elle forme, avec quatre protéines d'autres organismes, une nouvelle famille caractérisée par la présence de trois domaines dont deux de liaison à l'ARN. Afin d'étudier la structure par RMN et la fonction de cette protéine, nous avons réalisé cinq constructions plasmidiques en utilisant le système Gateway (Invitrogen) dont l'efficacité a été prouvée dans les programmes de génomique structurale. Nous avons ainsi exprimé quatre protéines de fusion (Histidine ou GST en N-terminal) simples et multi-domaines (de 10 à 50 kDa) et purifié, par chromatographie d'affinité et gel filtration, deux d'entre elles : (i) la protéine entière afin d'obtenir des anticorps qui serviront à sa caractérisation biochimique et localisation subcellulaire et (ii) une protéine de 20 kDa correspondant aux deux domaines C-terminaux, G-patch et RRM (RNA Recognition Motif) dont la caractérisation physicochimique pourrait nous renseigner sur les mécanismes d'action de cette nouvelle enzyme.

Yahiaoui B., Dzierszinski F., Bernigaud A., Slomianny C., Camus D., Tomavo, S., 1999, Mol. Biochem. Parasitol., 99, 223-235
Dendouga N., Callebaut I., Tomavo S., Eur. J. Biochem., 2002, 269, 3393-3401

Modifications des protéines mitochondriales avec l'âge : identification de cibles préférentielles de la glycoxydation

M.HAMELIN, J. MARY, A. SEVERE, B. FRIGUET & H. BAKALA

Laboratoire de biologie biochimie cellulaire du vieillissement, tour 23-33 case 7128,
2 place Jussieu 75 252 Paris, France

Le vieillissement se caractérise par un déclin graduel des fonctions cellulaires qui est associé à une accumulation de protéines endommagées et à un dysfonctionnement de la mitochondrie. Cette accumulation peut résulter d'une augmentation de l'altération des protéines et/ou d'une diminution de l'élimination des protéines endommagées. Avec l'âge, on observe une augmentation de la production des espèces réactives de l'oxygène (ERO) par la mitochondrie, source majeure de la production intracellulaire d'ERO et aussi cible privilégiée de ces ERO qui vont endommager les protéines mitochondriales elles-mêmes, et ainsi contribuer au dysfonctionnement de cet organelle. Les protéines peuvent être endommagées soit directement par les ERO soit indirectement par les groupements carbonyles réactifs dérivés de l'oxydation des carbohydrates et menant aux produits de glycoxydation comme la Ne-(CarboxyMethyl)Lysine (CML).
En utilisant des anticorps spécifiques des modifications glycoxydatives et oxydatives des protéines, nous avons montré une augmentation de la glycoxydation et de l'oxydation des protéines de la matrice mitochondriale de foie de rat (Wag/Rij) au cours du vieillissement. Cette accumulation est accompagnée d'une baisse d'activité de la protéase Lon dont la fonction est, justement, d'éliminer ces protéines endommagées. De plus, nous avons observé que seul un nombre restreint de protéines est ciblé par les modifications (CML), ces protéines représentent des bio-marqueurs potentiels du vieillissement cellulaire. D'autre part, dans le but de mieux cerner le rôle de ces modifications dans le dysfonctionnement mitochondrial avec l'âge, nous avons entrepris l'identification de ces protéines modifiées par une approche protéomique alliant électrophorèse bidimensionnelle, immunodétection et spectrométrie de masse.

Mots clés: Vieillissement, Mitochondrie, Carboxymethyllysine (CML), Glycoxydation, Oxydation.

Relation entre le taux du lactosylcéramide et la modulation de l'activité de transport de la daunorubicine par la P-glycoprotéine en présence de PSC833

N. AOUALI1, C. DUMONTET2, H. EL BTAOURI3, F. WRISEZ3, S. MALAGARIE-CAZEZNAVE4, T. LEVADE4, H. MORJANI1

1CNRS UMR6142 UFR de Pharmacie, IFR53, 51096 Reims, 2INSERM 590, UFR de Médecine Rockefeller, 69373 Lyon, France, 3CNRS FRE-2534, UFR Sciences Exactes et Naturelles, IFR53, 51687 Reims, France, 4 INSERM U.466, CHU Rangueil, 31059 Toulouse, France

Un intérêt accru s'est développé pour les micro-domaines membranaires portant le nom " detergent resistant micro-domaines " (DRM). Ces DRM sont constitués de sphingolipides, cholestérol et de protéines. La présence de la protéine P-glycoprotéine (Pgp) dans ces micro-domaines a été suggéré ainsi qu'une augmentation du taux de glucosylcéramide (GlcCer) et/ou lactosylcéramide (LacCer) dans les membranes de cellules tumorales multidrug-résistantes ou MDR.
A partir de cellules de carcinome d'utérus humaines MESSA, nous avons sélectionné deux sous-lignées résistantes, DX5 résistante à la doxorubicine (DOX) et GARF résistante à une association de DOX et vinblastine (VBL). Ces deux lignées surexpriment la Pgp. L'analyse des sphingolipides montre un taux de GlcCer important dans les cellules DX5 et GARF et un taux de lactosylcéramide (LacCer) important seulement dans les cellules GARF. Le traitement des cellules résistantes avec le PSC833 induit une réversion partielle de la résistance seulement dans les cellules DX5 en présence de daunorubicine (DNR). Cependant si le traitement des cellules GARF est précédé par un pré-traitement avec le PDMP (inhibiteur de la synthèse du GlcCer et par conséquent du LacCer) une réversion de la résistance à la DNR est accompagnée par une inhibition de l'activité de transport de la Pgp en présence de PSC833. Ceci confirme l'importance du LacCer dans la composition et la rigidité des DRM. Nous suggérons qu'un taux élevé de LacCer dans les RMD induirait un changement de conformation de la Pgp, et diminuerait son affinité au PSC833 et donc ferait en sorte que les cellules GARF ne soient plus sensibles à ce modulateur.

PROGRAMME ......... ACCUEIL