Lors du Congres international de Biochimie organisé à Marrakech (Maroc) en Mai 2004, le thème relatif à la Biochimie et Santé a connu un grand nombre d'interventions. Les communications émanant principalement de la France et des pays du Maghreb étaient remarquables

Étude d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de la rétrotranscriptase du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

J. DIDIERJEAN, C. ISEL, B. EHRESMANN, C. EHRESMANN, S. PIETTRE#, R. MARQUET

UPR 9002 du CNRS, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 15 rue René Descartes, 67084 Strasbourg, France et #UMR 6014 du CNRS, IRCOF, Université de Rouen, 76821 Mont St Aignan Cedex, France

La rétrotranscription de l'ARN viral en ADN proviral est une étape clé du cycle réplicatif du VIH-1. Elle est catalysée par la rétrotranscriptase (RT) qui est active sous forme hétérodimérique et qui possède une activité RNase H ainsi qu'une activité ADN polymerase ARN et ADN-dépendante. Les antiviraux dirigés contre la RT et utilisés en polythérapie sont, soit des analogues de nucléosides (NRTI) agissant comme terminateurs de chaîne lors de leur incorporation dans l'ADN en voie de synthèse, soit des inhibiteurs non nucléosidiques (NNRTI) ralentissant la vitesse de la catalyse en se fixant à proximité du site polymérase. Néanmoins, l'apparition rapide de mutations de résistance dans le gène de la RT confère une grande capacité d'échappement du virus à ces anti-rétroviraux.
Dans l'optique de trouver de nouvelles stratégies d'inhibition du VIH-1, nous avons étudié une classe de 16 composés potentiellement inhibiteurs de la RT du VIH-1 par chélation des ions Mg2+ présents dans les sites catalytiques polymérase et RNase H. Nous avons démontré que certains de ces composés inhibent les deux activités et que les composés les plus actifs sont différents sur l'activité polymérase et RNase H, suggérant une sensibilité de ces inhibiteurs à l'environnement protéique de leur site de fixation. L'inhibition de l'activité ADN polymérase ARN-dépendante, réversible, est non compétitive vis-à-vis des nucléotides. Ce mode d'action inattendu suggère que la fixation de l'inhibiteur dans le site actif n'affecte pas la fixation du nucléotide ou qu'il se fixe en dehors du site actif. La fixation de ces inhibiteurs dans le site de fixation des NNRTI est exclue, en raison de l'inhibition d'une RT résistante aux NNRTI (Y181C). De plus, ces inhibiteurs ne dissocient pas la RT. L'obtention de la structure cristallographique de la RT du VIH-1 libre ou complexée avec ses substrats, en présence de l'inhibiteur, ainsi que l'étude de mutants de la RT devraient nous permettre de mettre en évidence un mode d'action original.

Etude de la fixation de la protéine Vif du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) à son ARN génomique

S. HENRIET, J-C. PAILLART, E. DECROLY*, R. VIGNE*, B. EHRESMANN, C. EHRESMANN & R. MARQUET

UPR9002 du CNRS, IBMC, 15 rue René Descartes 67084 Strasbourg cedex, *Unité 372 INSERM, Campus de Luminy, BP 178,13276 Marseille cedex 9, France

La protéine Vif (Viral Infectivity Factor) du VIH-1 est indispensable à la pathogénèse virale. Parmi les cellules hôtes du VIH-1, on peut distinguer des lignées dites permissives, pour lesquelles le gène Vif n'est pas indispensable à la réplication virale et des lignées dites non permissives pour lesquelles l'absence de ce gène conduit à une perte d'infectivité des virions. Il a été montré que Vif possède une propriété de liaison à l'ARN et des mutants de Vif ayant perdu cette capacité rendent le virus non infectieux dans les lignées non permissives, soulignant l'importance de cette propriété dans le cycle viral. De plus, Vif interagirait directement avec l'ARN génomique du VIH-1 dans le cytoplasme permettant ainsi son encapsidation dans la particule virale. Récemment, un facteur de restriction cellulaire présent uniquement dans les lignées non permissives et dont l'action est contrecarrée par Vif a été identifié (protéine CEM15 ou APOBEC-3G). Alors que Vif semble avoir un effet sur l'efficacité de la rétrotranscription du génome du VIH-1, il a été montré que le mode d'inhibition par APOBEC-3G affecte également cette étape par un phénomène d'editing.
Afin de déterminer un site spécifique de fixation de Vif sur le génome du VIH-1, nous avons mesuré in vitro par des tests de rétention sur filtre et de retard de migration électrophorétique, l'affinité de la protéine recombinante GST-Vif pour des ARN synthétiques correspondant à diverses régions de l'ARN génomique. Nous avons observé que Vif est capable de fixer spécifiquement l'ARN et présente une forte affinité (Kd= 50-90 nM) pour la région 5' du génome, région très structurée et fortement impliquée dans la régulation de l'ARN génomique. Par ailleurs, il semble que la fixation de la protéine sur l'ARN s'effectue de manière coopérative. Des expériences de ladder selection associées à de la mutagenèse dirigée sur l'ARN du VIH-1 nous ont permis montrer que la protéine Vif se fixe de manière spécifique à la partie 5' non traduite, entre le site d'initiation de la rétrotranscription (PBS) et le signal d'encapsidation de l'ARN génomique ( ). Nous envisageons à présent de confirmer ces résultats par des expériences de coimmunoprécipitation des ARN viraux à partir de lysats de cellules H9 exprimant de façon constitutive la protéine Vif.

Sélénium et physiologie musculaire : le rôle de la sélénoprotéine N

M. REDERSTORFF, A. KROL & A. LESCURE

UPR 9002 du CNRS, IBMC, 15 rue René Descartes, 67084 Strasbourg Cedex, France

La sélénoprotéine N (SePN) est l'une des protéines contenant du sélénium nouvellement identifiée par une approche bioinformatique. Aucune fonction ne lui a été attribuée à ce jour. Toutefois, des mutations portées par son gène SEPN1 ont été corrélées à plusieurs formes de dystrophies musculaires congénitales, caractérisées notamment par une rigidité spinale ainsi que des contractures et des faiblesses musculaires s'accompagnant d'insuffisances respiratoires sévères.
De façon surprenante, l'expression de SePN n'est pas spécifique du muscle mais ubiquitaire dans tous les tissus étudiés. En revanche, le niveau d'expression est très supérieur dans les tissus embryonnaires comparés aux tissus adultes. Des études, en collaboration avec le groupe de P. Guicheney à l'Hôpital Pitié-Salpêtrière à Paris ont montré qu'il s'agissait d'une glycoprotéine membranaire associée au réticulum endoplasmique et que l'exon 1 correspondait à un signal d'adressage et de rétention dans ce compartiment.
Nous nous attachons désormais à la compréhension de la fonction moléculaire de SePN. Pour cela, l'identification de ses partenaires et/ou substrats putatifs constitue une étape clé. Nous avons produit plusieurs formes recombinantes de SePN qui ont permis de mettre en évidence des interactions avec des protéines partiellement purifiées à partir d'extraits cellulaires et immobilisées sur filtre. La purification de ces partenaires par des techniques de haute affinité et de co-immunoprécipitation est en cours ; les candidats obtenus seront identifiés par spectrométrie de masse.
Dans une deuxième approche, et afin de mieux comprendre le rôle physiologique de SePN dans le muscle, nous avons entrepris la mise au point d'un modèle murin de la pathologie dans lequel le gène SEPN1 est invalidé par recombinaison homologue. Nous avons d'ores et déjà obtenu plusieurs lignées embryonnaires transgéniques de souris qui serviront à générer, après réimplantation et croisements successifs, des souris délétées totalement ou conditionnellement du gène codant pour la sélénoprotéine N.

Mots-clés : sélénium, sélénoprotéine N, dystrophie musculaire, interactions protéine/protéine, modèle murin

A. BRIKCI-NIGASSA1, D. CHAABANE-SARI1, D. KROUF2.

1Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université de Tlemcen, Algérie, 2Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université d'Oran, Algérie.

L'intérêt porté aux altérations métaboliques des lipoprotéines plasmatiques observées généralement chez les diabétiques de type 1 et 2 repose sur les liens entre ces troubles et l'apparition des complications cardiovasculaires. Notre travail s'est basé sur l'évaluation des troubles lipidiques et lipoprotéiques chez des diabétiques insulinodépendants (DID) et insulinonécessitants (DIN) dans la région de Tlemcen (n=24 : 12 femmes de 28 à 52 ans et 12 hommes de 28 à 58 ans). Tous les patients et témoins ont été sélectionnés selon divers critères (pas de médicament, de pathologie ni d'état physiologique pouvant interférer avec le métabolisme lipidique et lipoprotéique).
Les deux groupes de diabétiques n'ont présenté aucune variation significative des teneurs sérique en HDL-cholestérol, triglycérides, Lp(a) et acides gras non estérifiés comparés aux témoins. Par contre, les taux de CT sont abaissés chez les DID hommes et les DIN femmes, et les LDL-C et apo B sont diminués chez les DID des deux sexes et les DIN femmes par rapport aux témoins.
Les deux groupes de diabétiques ont présenté aussi une augmentation de l'Apo A-I, cofacteur de la LCAT, comparés aux témoins. Les phospholipides des sous-fractions HDL3, substrats de cette enzyme, sont augmentés chez les DIN hommes mais restent normaux pour le reste de la population diabétique comparée aux témoins. La détermination de l'activité de la LCAT a révélé une augmentation chez les DID quel que soit le sexe.
En conclusion, l'ensemble des diabétiques ne montrent pas de variation défavorable des marqueurs des maladies cardiovasculaires (HDL-C, triglycérides, LDL-C et Lp(a)), suggérant l'absence de profil athérogène. De plus, ces diabétiques présentent des profils lipidiques et lipoprotéiques très proches, ce qui suppose que le type de traitement, en l'occurrence l'insulinothérapie, influe sur ces profils.

Mots-clés : Diabète insulinodépendant, Diabète insulinonécessitant, insulinothérapie, lipoprotéines, LCAT.

Recherche des gènes modulant la surcharge en fer dans un modèle murin d'hémochromatose

M. BENSAID 1,3, S. FRUCHON1, C. MAZERES1, S. BAHRAM2, A. SOULEIMANI3, M-P. ROTH1 & H. COPPIN1

1 INSERM U563, CHU Purpan, Toulouse, France, 2 Centre de Recherche d'Immunologie et d'Hématologie, Strasbourg, France, 3 Faculté des Sciences Dhar mehrez, Fès, Maroc

L'hémochromatose est une maladie autosomique récessive caractérisée par une absorption excessive du fer au niveau duodénal et une accumulation progressive de ce fer dans les organes parenchymateux. En l'absence de traitement, elle s'accompagne à partir de 40 ans de complications sévères (cirrhose, carcinome hépatocellulaire, diabète…). Plus de 90% des individus atteints d'hémochromatose sont homozygotes pour la mutation C282Y du gène HFE. Néanmoins, tous les individus porteurs de cette mutation ne développent pas une surcharge en fer importante et ne présentent pas les complications caractéristiques de la maladie. Des facteurs environnementaux (abus d'alcool, régime alimentaire…) et des facteurs génétiques sous forme des gènes modulateurs peuvent contribuer aux variations phénotypiques observées. Les interactions complexes entre ces différents facteurs rendent difficile la recherche des gènes modulateurs chez l'homme. Notre travail vise à identifier les facteurs génétiques modulant l'expression phénotypique de la maladie en utilisant un modèle murin d'hémochromatose : les souris invalidées pour le gène HFE. Nous avons produit 1028 hybrides F2 provenant du croisement entre souris DBA/2 Hfe-/- développant une surcharge en fer intrahépatique élevée et souris C57BL/6 Hfe-/- qui développent une surcharge beaucoup moins importante. Nous avons montré que chez les souris F2 environ 62% de la variance du fer intrahépatique était d'origine génétique. Par criblage de génome de 276 hybrides à l'aide de 145 marqueurs microsatellites, nous avons identifié quatre régions contenant des gènes modificateurs sur les chromosomes 7, 8, 11 et 12. L'analyse des gènes candidats contenus dans ces régions ainsi que de leurs homologues chez l'homme permettra de comprendre les facteurs influençant la pénétrance et la sévérité de l'hémochromatose.

Mots clés : Hémochromatose, gènes modulateurs, souris invalidées pour le gène HFE.

Etude des effets biologiques de la lebectine, une lectine de type-C issue du venin de Macrovipera lebetina, sur certaines lignées de cellules cancéreuses

S. SARRAY1, J. LUIS2, J. MARVALDI2, M. El AYEB1
& N. MARRAKCHI1

1 Laboratoire des venins et toxines. Institut Pasteur de Tunis, 13, Place Pasteur, BP-74, 1002 Tunis Belvedère, Tunisie, 2 CNRS UMR6032, Faculté de Pharmacie, 27 Bd J. Moulin, 13385 Marseille Cedex 5, France.

Bien que les serpents sont refoulés par nos cultures, ces animaux et plus particulièrement lerurs venins pourraient porter en eux l'avenir de la Médecine. En effet, plusieurs molécules extraites des venins de serpents se sont avérées des agents anti-agrégants plaquettaires et/ou anti-tumoraux potentiels. Ces molécules appartiennent essentiellement à deux grandes familles; les désintégrines et les lectines. Ces dernières constituent un groupe protéines non enzymatiques structurallement homologues aux lectines animales. Elles présentent une très forte homologie structurale en dépit de leur divergence d'activité.
Les travaux du laboratoire des Venins et Toxines sur les venins de serpents s'inscrivent dans le cadre de la recherche de nouvelles molécules candidates à potentiel antimoral. Le fractionnement de venin de Macrovipera lebetina nous a permis de purifier et caractériser une nouvelle molécule appellée lebectine, Cette protéine est une nouvelle C-lectine protéine ayant une structure homodimérique douée d'activité anti-proliférative, anti-adhésive, anti-migratoire et anti-invasive sur certaines lignées de cellules cancéreuses. Un effet inhibiteur de la multiplication des cellules mélanomateuses (IGR39) et les cellules issues d'un fibrosarcome (HT1080) a été observé. La lebectine (à 25 µg/ml) inhibe de manière dosodépendante l'adhésion de ces lignées sur les protéines de la matrice extracellulaire. Cette inhibition est intégrine dépendante. Les tests de migration dans les chambres de boyden ont révélé une inhibition complète (à 25 µg/ml de lebectine) des cellules HT1080 vers la fibronectine. De même l'invasion métastatique de ces cellules dans le gel de fibrine est également inhibée à 100% en présence de la lebectine utilisée à différentes concentrations (0 µg/ml-10 µg/ml). Des tests complémentaires ont été également effectués afin d'identifier l'intégrine impliquée dans ces effets observés, La lebectine agirait via l'intégrine av et probablement a5ß1.

Les radicaux libres : des intermédiaires de signalisation dans la transduction du signal couplé à la protéine prion cellulaire.

M. PIETRI1, B. SCHNEIDER1, S. MOUILLET-RICHARD1, M. ERMONVAL1, J-M. LAUNAY2 & O. KELLERMANN1.

1Laboratoire Différenciation Cellulaire et Prions, CNRS UPR 1983 et Institut Pasteur, 7 rue Guy Môquet, 94801 Villejuif Cedex, France. Tel : + 33 1 49 58 33 33, Fax : + 33 1 49 58 33 29, 2Hôpital Lariboisière, 75010 Paris Cedex.

Les Encéphalopathies Subaiguës Spongiformes Transmissibles (ESST) sont des affections dégénératives du système nerveux central engendrées par l'accumulation d'un conformère toxique de la protéine prion cellulaire (PrPC), que l'on nomme protéine prion scrapie (PrPSC). La PrPC est une protéine ubiquitaire, ancrée à la surface cellulaire par un groupement GPI. Elle est abondante dans les neurones qui constituent les cellules cibles des ESST. Les souris invalidées pour le gène de la PrP C n'ont pas permis de déterminer le rôle physiologique de la PrPC puisqu'elles ne présentent aucune altération phénotypique majeure. Toutefois, les cellules cérébelleuses isolées à partir de souris PrP0/0 ou des cellules neuroendocrines infectées par la PrPSC ont une sensibilité accrue à un stress oxydant induit. Pour appréhender le rôle de la PrPC, nous bénéficions du modèle de différenciation neuronale 1C11. En présence d'inducteurs, les cellules 1C11 se différencient en neurones sérotoninergiques (1C115-HT) ou noradrénergiques (1C11NE)(1). En mimant un signal d'activation de la PrPC à l'aide d'anticorps, on a identifié pour la première fois une voie de signalisation couplée à la PrPC. Le crosslinking de la PrPC induit une activation de la kinase intracellulaire Fyn. Ce couplage est relayé par une protéine membranaire, la cavéoline-1. La mise en place du complexe de signalisation PrPC-Cav-Fyn est spécifique des cellules différenciées ayant acquis un phénotype neuronal sérotoninergique ou noradrénergique complet.(2)
La recherche de cibles intracellulaires en réponse à la stimulation de la PrPC nous a permis d'établir un lien biochimique entre la PrPC et l'équilibre redox cellulaire. La stimulation de la PrPC par des anticorps entraîne une production de dérivés hautement réactifs de l'oxygène (ROS), dépendante de la NADPH oxydase. Cette activation est observée dans les cellules 1C115-HT et 1C11NE mais aussi dans les cellules précurseur 1C11 ainsi que dans les lymphocytes T. Ces résultats suggèrent une fonction ubiquitaire de la PrPC dans le contrôle de l'état d'oxydoréduction de la cellule. Les ROS ainsi produits agissent en tant que " second messager " et contrôlent la phosphorylation d'une classe de MAP Kinases : les " Extracellular Regulated Kinases 1/2 " (ERK1/2). Dans les cellules souches 1C11 et les lymphocytes T, les ROS générés par la ligation de la PrPC gouvernent totalement l'activation de ERK1/2. De plus, dans les neurones bioaminergiques 1C115-HT et 1C11NE, on a pu confirmer une spécificité neuronale dans la fonction de signalisation de la PrPC. La plate-forme PrPC-Cav-Fyn contrôle l'activation de ERK1/2 par le recrutement de plusieurs voies de transduction, dont l'une fait intervenir la NADPH oxydase (3). Ainsi, ces résultats établissent un lien fonctionnel entre PrPC, production de radicaux libres et ERK1/2, un facteur de survie cellulaire.

Mots clés : Protéine prion, signalisation, radicaux libres.

1Mouillet-Richard S. et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 13 :9186-9192.
2Mouillet-Richard S. et al, 2000, Science, 289 :1925-1928.
3Schneider B. et al., PNAS, sous presse.

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