Résumé

Lorsqu'au 19^ième siècle, Payan découvrit la diastase (1833) et Bernard la lipase pancréatique (1849), nul ne pouvait imaginer qu'il s'agissait des premiers maillons d'une famille de biocatalyseurs susceptibles d'entraîner une révolution technologique 150 ans plus tard.

L'avenir de ces "diastases" - converties en enzymes selon la proposition de Kuhne en 1878- pouvait d'autant moins être perçu, que l'on ignorait encore tout de la microbiologie, source principale des enzymes industrielles dont nous disposons aujourd'hui.

C'est en effet la connaissance et la maîtrise scientifiques des fermentations qui a progressivement fait concevoir l'intérêt d'utiliser non plus le micro-organisme entier mais seulement son principe actif pour réaliser une transformation définie d'un substrat biochimique. Depuis deux décennies, l'emploi des enzymes connaît un succès remarquable et entrouvre des perspectives étonnantes: nombre de procédés classés comme "biotechnologie" reposent sur une exploitation des propriétés particulières de ces mécanismes réactionnels. De nouvelles industries n'ont vu le jour que grâce à la mise sur le marché d'enzymes purifiées; il en est de même pour des techniques de détection et d'analyses dont le principe utilise la sensibilité et la spécificité enzymatiques.

L'avenir de ces réactifs va dépendre pour une part importante, du coût de leur utilisation. C'est pourquoi les techniques d'encapsulage et de greffage ont constitué un progrès technologique ouvrant de plus grandes possibilités d'emploi; des recherches s'imposent encore pour abaisser les prix d'une opération enzymatique à l'échelle industrielle.

L'utilisation d'enzymes en technologie alimentaire, pour la transformation de la matière première, n'est pas une nouveauté technologique: la fabrication de pain, de boissons ou de fromages faisant depuis longtemps appel à de tel procédés.

Cependant, depuis quelques années, le développement de nouveaux produit alimentaires d'une part, leurs exigences technologiques organoleptiques et nutritionnelles de l'autre, ont créé de nouveaux besoins et un nouveau marché, celui des produits de synthèse utilisés dans les industries de seconde transformation: acides organiques, composés responsables des arômes et de la flaveur, édulcorants, corps gras à valeur nutritionnelle déterminée. Ces produits obtenus d'abord par extraction, fermentation ou synthèse organique le sont de plus en plus à l'heure actuelle par synthèse enzymatique.

1. Synthèse de composés responsables de la flaveur et des arômes

Les micro-organismes utilisés traditionnellement dans la fabrication des produits alimentaires produisent, par l'intermédiaire de leurs enzymes, des métabolites (acides, alcools, lactones, esters, aldéhydes, cétones, etc.) responsables majeurs de la flaveur. C'est d'ailleurs l'accumulation de ces composés qui caractérise le goût final du produit. Les micro-organismes et les enzymes constituent donc une excellente source de production de ce type d'ingrédients.

L'approche microbiologique est irremplaçable pour produire des mélanges complexes de composés (transformation des acides gras, des protéines et des sucres lors de la fabrication et de l'affinage des fromages par exemple ou production d'acide butyrique, d'acide propionique, de méthyl cétones, etc.).

L'approche enzymatique est plus intéressante pour la synthèse de certaines substances responsables d'une flaveur particulière: citons pour mémoire la synthèse de composés carbonylés de faible poids moléculaire comme le diacétyle par décarboxylation de l'acide a acéto-lactique ou l'acétaldéhyde par oxydation de l'éthanol déshydrogénase (Raymond, 1984).

Yokozeki et al. (1982) et Stevenson et al. (1979) ont réussi à l'aide de lipases microbiennes la synthèse d'esters propioniques, butyriques et caproïques du géraniol et du citronellol. L'utilisation d'enzymes immobilisées dans des conditions expérimentales particulières devrait permettre dans les années à venir la synthèse de composés intéressants. Différentes équipes, tant en France qu'à l'étranger, ont mis au point la synthèse de géranial à partir du géraniol par l'alcool déshydrogénase de foie.

Signalons enfin la synthèse du composé responsable de l'arôme de moutarde: le gôut piquant de la moutarde, du cresson ou du radis noir est dû à la formation des huiles de moutarde ou isothiocyanates à partir des précurseurs (glucosinolates) sous l'action de la myrosinase. Utilisant la myrosinase fixée, Gatfield et Schmidt-Kastner (1983) produisent en continu l'arôme de moutarde dans des conditions industrielles très intéressantes.

Ils sont de plus en plus utilisés dans certains "aliments de synthèse" d'abord au Japon puis petit à petit partout dans le monde. Ils sont actuellement produits par fermentation microbienne ou synthèse enzymatique, en combinaison pour certains, avec des méthodes chimiques.

Deux nucléotides exhausteurs de goût, l'inosine 5' monophosphate (5' IMP) et la guanosine 5' monophosphate (5' GMP), sont actuellement produits par hydrolyse des acides nucléiques suivie d'une désamination. Ainsi l'utilisation d'une 5' phosphodiesterase bactérienne permet-elle de libérer les nucléotides (5' AMP, 5' GMP, 5' UMP); une 5' AMP désaminase libèrera dans le milieu le 5' IMP.

Le glutamate de sodium est un des composés exhausteurs de goût produit en très grandes quantités (plusieurs milliers de tonnes produites et utilisées) dans le monde. La quasi totalité est synthétisée pour l'heure par fermentation microbienne avec d'autant plus d'intérêt que seul l'isomère L est produit et excrété dans le milieu de culture.

Signalons, cependant, que les techniques utilisant des hydrolases fixées permettent de fabriquer l'acide L glutamique par hydrolyse du DL propionate 5' hydantoïne.

La percée du génie enzymatique dans ce secteur d'activité est faible à cause de la concurrence des procédés chimiques et microbiologiques. Néanmoins, nous pensons qu'il s'agit plus d'une déficience en investissements intellectuel et économique que d'une réalité scientifique, ce secteur d'activité étant un de ceux qui à terme est porteur des plus belles promesses.

Les acides organiques tels que l'acide gluconique, certains acides aldoniques, l'acide L-malique ou l'acide L-tartrique sont utilisés à l'heure actuelle dans les I.A.A. soit comme matière première pour les industries de seconde transformation, soit comme acidulants et/ou complexants dans certains procédés de fabrication ou pour la production de certains aliments.

Ainsi la synthèse d'acide gluconique à partir de glucose s'effectue t-elle par voie enzymatique en utilisant le système séquencé glucose oxydase + catalase soit à l'état libre, soit immobilisé.

La société américaine CPC et l'Institut Battelle de Genève ont mis au point des procédés permettant de travailler en phase homogène avec des enzymes immobilisés mais "hydrosolubles"; des solutions de glucose à 400 g/l sont ainsi oxydées avec des rendements très importants.

Là encore, l'industrie japonaise possède une longueur d'avance.

• La firme Hayashibara a mis au point un procédé permettant, à partir de mono, -di et -tri-saccharides, de préparer les acides aldoniques correspondants par catalyse enzymatique utilisant des systèmes oxydasiques extraits de Pseudomonas fragi .

• La firme Tanabe synthétise grâce à une fumarate ligase fixée de Brevibacterium ammoniogenes l'acide malique à partir de l'acide fumarique.

• De même, la firme Toray Industries envisage-t-elle de synthétiser en continu l'acide L-tartrique à partir de l'acide maléique en combinant oxydation chimique et hydrolyse enzymatique par des hydrolases spécifiques extraites d'Acinetobacter antarogenes ou de Rhizobium validum suivant le processus présenté suivant le processus présenté dans la figure .

Depuis les travaux de Chibata et de son équipe dans les années 1960-1970, on assiste à la mise au point de procédés de préparation d'acides aminés qui font une large part à la synthèse enzymatique. Ainsi, L-méthionine, L-lysine, L-aspartate, L-tryptophane, L-cystéine, L-alanine, L-tyrosine, L-phényl alanine peuvent-ils être préparés par la mise en oeuvre d'enzymes spécifiques soit seuls soit associés (tableau ).

Pour un nombre important d'acides aminés la combinaison des méthodes chimiques et enzymatiques est très avantageuse; une réaction chimique simple permet souvent de préparer un mélange racémique DL amino acide. Le dédoublement du racémique, difficile par voie chimique, devient aisé par voie enzymatique en utilisant une amino acylase fixée, selon le schéma de la figure .

L'aspartame est un dipeptide constitué d'acide L-aspartique et de L-phénylalanine méthylène; sa structure est représentée figure .

En réalité, trois voies sont à l'heure actuelle utilisée pour sa synthèse. La synthèse chimique, la synthèse enzymatique et la voie directe issue du génie génétique et utilisant la méthode de "l'ADN" recombinant.

En ce qui concerne les procédés enzymatiques, plusieurs techniques ont été décrites. Isowa et al. (1979) ont été les premiers à utiliser une métallo-protéinase, la thermolysine pour former une liaison peptidique entre le N-benzyloxycarbonyl L-aspartate (Z-L Asp) et la L-phénylalanine méthylester (Z-L PheOMe) selon l'équation ci-dessous :

Z-L Asp + L PheOMe à Z-L Asp - L PheOMe + H₂O (thermolysine)

Oyama et al. (1984) utilisent la thermolysine fixée et travaillent en solvant organique, ce qui permet une séparation aisée des constituants, le Z-L Asp - L PheOMe se dissolvant aisément dans un solvant organique comme l'acétate d'éthyle par exemple. La firme Toyosada utilise une technologie analogue pour réaliser la condensation. Si à l'heure actuelle l'aspartame du commerce est issu pratiquement de la synthèse chimique, à terme, la synthèse enzymatique devrait prendre le pas grâce à son excellent rendement et à sa spécificité.

Le stévioside est glucoside édulcorant extrait normalement de Stevia rebaudiana. Sa structure chimique naturelle fait qu'il présente normalement un goût amer. Par action d'une a-glucosidase le goût amer est supprimé et le produit obtenu présente un pouvoir sucrant environ 200 fois supérieur à celui du saccharose.

Les cyclodextrines sont comme l'indique leur nom, des dextrines cyclisées, c'est-à-dire des polymères de six, sept, huit (ou plus) molécules de glucose unies par des liaisons 1-4; selon le degré de polymérisation on obtient des a, b, et g-cyclodextrines; elles sont synthétisées à partir de dextrines ou d'amidon par une enzyme, la cyclodextrine-glycosyl transférase d'origine microbienne (Bacillus macerans, entre autres) (Mercier, 1985).

Leur pouvoir séquestrant vis-à-vis des arômes volatils (Vincent, 1989) et des huiles essentielles les fait utiliser dans les techniques d'encapsulation moléculaire (extraits d'oignon, fenouil, estragon, etc.). A terme, ces mêmes propriétés permettent d'envisager leur utilisation dans la réalisation de catalyseurs enzymatiqes artificiels (Maury et Roque, 1986).

L'utilisation des enzymes est, selon le cas, destinée à faciliter le procédé, améliorer la conservation et/ou les caractéristiques organoleptiques ou nutritionnelles, corriger des déficiences naturelles ou permettre la valorisation de certains sous-produits.

Parfois aussi, la technologie aura pour but d'optimiser l'action des enzymes présentes dans la denrée et seules responsables de la transformation (évolution du muscle en viande par exemple, maturation des fruits, etc.)

Tous les secteurs de l'industrie agro-alimentaire (boulangerie, brasserie, distillerie, jus de fruits, laits et dérivés, vins) sont susceptibles de telles applications. Il n'est pas dans mon intention de reprendre par le détail la liste de tous les enzymes utilisées ainsi que la séquence ou les subtilités de leur utilisation, des revues exhaustives (Durand et Monsan, 1982; Dupuy, 1982; Cerning et al., 1984) ont ces dernières années fait le point sur la question; je me contenterai donc de prendre des exemples dans les différents secteurs afin de montrer l'interêt présent et/ou futur de cette technologie ainsi que les variations qu'elle propose ou permet d'envisager.

Je me contenterai dans cet article de résumer l'essentiel des connaissances exposées de façon très complète dans de nombreux articles (Pehlan et al., 1977 et Cerning et al., 1984) ou même des ouvrages (Eck, 1984).

La préparation enzymatique traditionnellement utilisée, dans le monde, la présure, est un extrait de caillette de veau nourri au lait. Elle contient deux enzymes coagulantes, la chymosine et la pepsine qui représente 20% de l'activité coagulante totale. Les préparations commerciales sont souvent des mélanges de présure et de pepsine bovine. Aux Etats-Unis, la pepsine de porc est largement utilisée sous forme de mélange 50/50 avec la présure.

A côté de ces enzymes l'industrie fromagère utilise aussi (peu en France mais de façon importante aux Etats-Unis) les protéases d'origine microbienne, protéases acides présentant comme la présure un centre catalytique à résidu aspartyle.

Tous ces systèmes enzymatiques sont la plupart du temps utilisés en mélange direct. Des essais ont cependant été entrepris pour fixer les enzymes sur une phase insoluble; les problèmes de transfert liés à la formation du caillé d'une part et la participation au processus d'affinage de ces protéases de l'autre sont cependant loin d'être encore résolus et constituent un frein à cette technologie.

Processus lent et coûteux en immobilisation de capital, l'affinage bénéficie depuis quelques temps des efforts de la recherche tendant à une meilleure maîtrise des processus et à leur accéleration par l'utilisation d'enzymes exogènes, protéases, lipases, décarboxylases. Le problème est cependant complexe et plusieurs questions restent encore sans réponse.

• Quelles quantités d'enzymes? L'addition de telles enzymes en faibles quantité améliore le goût et accélère l'affinage du caillé; L'augmention de la concentration en enzyme conduit par contre à des défaut de texture et de flaveur et au développement d'une amertume plus grande. L'intensité et la spécificité de la protéolyse sont en cause. Les données technologiques du process (temps, températures) doivent, elles-mêmes, être redéfinies pour chaque cas.

• Quelle technique d'addition? Plusieurs pratiques, pour ne pas dire plusieurs écoles, existent avec chacune des avantage et des inconvénients. Pour les uns, l'addition au lait et la plus pratique bien qu'elle d'entraîner d'une part une déstabilisation trop importante des caséines, donc un mauvais rendement de coagulation, et que de l'autre le faible taux de rétention des enzymes d'affinage dans le caillé ne soit pas satisfaisant du point de vue économique. Pour d'autres, c'est l'incorporation dans le caillé (soit en dilution dans la saumure, soit en mélange avec le sel) qui est la plus satisfaisante, oubliant à l'occasion que les phénomènes de diffusion dans le caillé risque aussi d'entraîner forcément des inégalités géographiques d' hydrolyse de la pâte.

La solution idéale consisterait donc à encapsuler les enzymes dans des structures qui, mélangées au lait, seraient retenues dans les mailles du caillé (par liaison ionique par exemple) et relargueraient par la suite à l'extérieur les enzymes de l'affinage. Plusieurs équipes de recherche s'intéressent à l'heure actuelle à cette voie. L'utilisation des liposomes par les chercheurs de l'INRA et leurs premiers résultats constituent peut-être une voie d'avenir (Piard et Alkhalaf, 1986).

Si les protéases agissent surtout sur la texture, les lipases agissent essentiellement sur le goût. Elles sont utilisées pour la fabrication de certains fromages et en particulier des fromages bleus ou iltaliens (Romano, Provolone). Le goût piquant caractéristique est dû à la présence d'acides gras à courte chaîne , libérés par les lipases présentes dans les préparations en pâte de la présure utilisée pour la fabrication de ce type de produit.

L'utilisation de lipase extraite de Mucor miehei et de certaines souches de Penicillium roqueforti conduit aux mêmes résultats.

L'intensité de la lipolyse de la matière grasse du lait dans la fabrication du fromage bleu est d'une importance capitale. Non seulement les acides gras libérés contribuent à la flaveur, mais ils servent de substrat aux lipoxygénases et autres oxydo-réductases fongiques pour la production de cétones, d'aldéhydes substitués et d'alcools, supports du goût de certains fromages. Comme pour les protéases, l'addition d'enzymes exogènes de ce type diminue considérablement le temps d'affinage.

A côté des enzymes directement liés à l'industrie fromagère, d'autres enzymes sont utilisées dans ce secteur, soit pour protéger la matière première, soit pour faciliter certains traitements technologiques, soit pour la valorisation des sous-produits.

on peut citer l'utilisation:

• Du lysozyme spécifique des polyosides de la paroi de certaines bactéries comme Clostridium tyrobutyricum susceptible de métaboliser l'acide lactique en acide butyrique, ce qui entraîne des troubles de formation de la pâte fromagère. L'addition de lysozyme au lait servant à la fabrication supprime ces accidents.

• De la glucose oxydase capable d'oxyder le glucose avec production d'acide gluconique et libération d'H₂O₂. Ce peroxyde d'hydrogène a un effet bactéricide direct. Un système d'enzymes couplées (b-galactosidase/glucose oxydase) fixées sur du verre poreux a déjà été utilisé pour la stérilisation à froid du laiten remplacement de la de la réfrigération ou de la pasteurisation. L'excès de peroxyde d'hydrogène est éliminé par l'action d'une catalase exogène (foie de bœuf ou A.niger par exemple).

• De la sulfhydryle oxydase. Cette enzyme présente en faible quantité dans le lait est capable d'oxyder les groupements thiols des protéines en provoquant la synthèse de ponts S-S selon le schéma suivant:

2 RSH + O₂ à RSSH + H₂O₂

Après extraction du lactosérum-présure par chromatographie, et immobilisation sur support, elle est susceptible d'améliorer la flaveur du lait UHT (suppression du goût de cuit dû à l'oxydation de certains résidus cystéinyl).

• De la superoxyde dismutase (SOD). Cette enzyme neutralise par réduction les radicaux oxygène libres selon la réaction:

2O₂ + 2H⁺ à H₂O₂ + O₂

Couplée avec la catalase c'est un inhibiteur efficace de l'oxydation anarchique des lipides dans les produits laitiers. Le traitement du lait, pour stockage prolongé avec cette enzyme en association avec la catalase, a été envisagé.

Les différents problème d'ordre nutritionnel (déficience en lactase intestinale de certains individus), organoleptique (faible pouvoir sucrant du lactose) ou technologique, dus à la faible solubilité de ce sucre en milieu aqueux, à sa propension à cristalliser, à sa non fermentescibilité directe) peuvent être résolus par son hydrolyse au moyen d'une b-galactosidase.

De nombreuses b-galactosidases d'origine végétale, animale ou microbienne peuvent être utilisées. Les laboratoires Corning ont mis au point un procédé industriel d'hydrolyse du lactosérum et de jus lactosé par une b-galactosidase immobilisée sur céramique.

Les différentes possibilités d'utilisation des b-galactosidases dans l'hydrolyse du lactose ont déjà été recensées par Baret (1982). Les domaines d'application de cette technologie se répartissent comme suit:

• production de lait et de produits dérivés à faible teneur en lactose (pour les populations déficientes en lactase ou pour augmenter le goût sucré de certains produits); du lait à lactose hydrolysé est commercialisé et vendu plus cher que le lait normal aux USA et en Italie;

• accélération de la fabrication de fromage et yaourt par augmentation du pouvoir fermentaire et/ou modification du pH;

• préparation de poudres de lait pour crèmes glacées et produits cuits;

• production de sirops et d'édulcorants pour l'industrie alimentaire.

Elles sont pour la plupart du temps utilisées comme aide technologiques:

• Soit pour corriger certaines déficiences de la matière première (grains et farines) dues souvent à une conjonction de facteurs agronomiques, climatiques et technologiques; il en est ainsi de la farine de blé malté ou d'a-amylase fongique (Aspergillus oryzae) pour améliorer le pouvoir fermentaire des farines du commerce.

• Soit pour ajuster les propriétés de la pâte aux contraintes du pétrissage moderne ou aux caractéristiques technologiques (biscuiterie par exemple) ou organoleptiques des produits finis; l'utilisation de protéases de Bacillus subtilis pour l'hydrolyse ménagée du gluten ou de lipoxygénase (linoléate: oxygène-oxydoréductase) issue de la farine de soja déshuilée ou de farine de fève, pour améliorer les propriétés de viscoélasticité de la pâte et son blanchiment, constitue une pratique courante de ce secteur industriel.

Parmi les enzymes quantitativement les plus utilisées dans les I.A.A., trois le sont en glucoserie, c'est-à-dire dans les opérations de transformation de l'amidon en sucres simples. Il s'agit essentiellement d'enzymes bactériennes: a-amylase, amyloglucosidase et glucose isomérase utilisées pour la fabrication des sirops de glucose et de fructose (HFCS: High Fructose Corn Syrup).

L'a-amylase fongique et la b-amylase de soja sont aussi utilisées pour transformer l'amidon en sirops à haute teneur en maltose.

Enfin, deux autres enzymes participent aussi à cette dégradation de l'amidon; il s'agit d'enzymes dit de branchement capables d'hydrolyser les liaisons a 1-6 comme la pullulanase. La participation de ces enzymes est d'autant plus justifiée que les amidons utilisés en glucoserie contiennent 75 à 85% d'amylopectine.

La séquence des opérations enzymatiques, leur couplage avec les traitements physico-chimiques associés (pH, oxygène, etc.), l'origine des enzymes elles-mêmes, varient dans le détail selon les entreprises. Des revues bibliographiques exhaustives et trés précises dans ce domaine ont déjà été publiées.

Les produits obtenus ont reçus de multiples applications; leurs propriétés physico-chimiques (hygroscopicité et autres propriétés fonctionnelles) expliquent pour une large part leur entrée en force dans pratiquement tout les secteurs des I.A.A. (fermentations, confiserie, boissons, crèmes glacées, entremets, confitures, aliments diététiques et infantiles, etc.).

Des quatre enzymes utilisées dans ce secteur, trois le sont en temps qu'auxiliaires technologiques susceptibles de faciliter la cristallisation du saccharose lors de l'extraction ou du raffinage de ce sucre.

Ainsi, l'utilisation d' a-amylase bactérienne pour hydrolyser les contaminants amylacés naturels ou de dextranase fongique pour éliminer les dextranes dus à Leuconostoc mesenteroïdes, permet de diminuer la viscosité des jus de canne et sirops de sucre et faciliter en retour la cristallisation du saccharose. Il en va de même de la mélibiase, enzyme utilisée pour l'hydrolyse du raffinose (anticristallisant du saccharose) qui se concentre dans la mélasse au fur et à mesure de son "épuisement" en saccharose.

La quatrième enzyme utilisée dans ce secteur est une enzyme de "production", l'invertase (entraînant une inversion du pouvoir rotatoire de la solution). Industriellement deux types de sirops sont préparés par cette technique: l'interverti moyen qui contient encore 50% de saccharose et l'interverti total constitué de 50% de fructose et de 50% de glucose. Bien que possédant de nombreux avantages, ces produits sont en compétition avec les sirops de glucose et d'isoglucose dans la plupart des secteurs agro-alimentaires.

Les procédés industriels de préparation des boissons (distillerie, brasserie, vinification, jus de fruits) font une large part à l'utilisation d'enzymes (essentiellement les hydrolases) pour faciliter, soit la fermentation, soit les techniques de préparation (extraction, clarification, filtration) soit la conservation des produits (stabilisation).

Dans le domaine de la distillerie, la production d'alcool par fermentation de l'amidon grâce aux levures, nécessite dans les premières étapes, l'utilisation d'enzymes pour liquéfier (a-amylase de Bacillus licheniformis) puis saccharifier (amyloglucosidase d'Aspergillus niger), l'amidon.

Dans les processus de brasserie, l'utilisation des enzymes vise à compenser d'une part la faiblesse diastasique des matières premières fréquemment utilisées (malt, orge cru, grifts de maïs, brisures de riz, etc.) et à faciliter d'autre part la mise en oeuvre des techniques de filtration ou de stabilisation des produits. La première des opérations est réalisée généralement par un mélange a-amylase ou amyloglucosidase + b-glucanase + protéase neutre. Les opérations d'extraction et de filtration sont aussi considérablement améliorées par l'utilisation de b-glucanase ou parfois de complexes enzymatiques (hémicellulases, pectinasese, etc.) d'origine fongique.

Les enzymes utilisées au début étaient celles de Bacillus subtilis; actuellement la firme Glaxo commercialise une b-glucanase (de Penicillium emersonii) encore active à 80°C et Genencor produit une enzyme identique pratiquement thermostable.

Le recours à de telles pratiques est d'autant plus nécessaire que la matière première utilisée contient d'avantage de malt de mauvaise qualité, d'orge cru ou tout autre composé susceptible d'amener des quantités importantes de b-glucanes et autres hémicelluloses augmentant la viscosité des solutions et par là même, compliquant les processus de filtration.

L'adjonction de ces systèmes enzymatiques se fait soit à l'empâtage du malt, soit durant la garde de la bière. Le trouble colloïdal qui se manifeste parfois lors du stockage à froid de la bière est dû à la formation des complexes entre les composés polyphénoliques (tannoïdes et tannins) et des fractions protéiques de la bière. Cette phase dispersée tannins-protéines présente une solubilité plus faible aux basses températures, ce qui explique l'apparition du trouble lors du stockage au froid. Dés lors, pour maintenir la stabilité, il suffit d'hydrolyser soit les protéines soit les tannins. La dégradation des protéines est obtenue par adjonction d'endoprotéases (papaïne, ficine, bromélaïne ou pepsine), celle des tannoïdes et tannins par action d'une "tannase" produite par des moisissures du genre Aspergillus. Une voie accessoire consiste aussi à empêcher la condensation des composés phénoliques simples en tannoïdes puis en tannins en éliminant l'oxygène nécessaire aux processus d'oxydation par l'utilisation du couple glucose oxydase + catalase.

Le grain de raisin contient des substances pectiques, macromolécules de nature glucidique composées essentiellement de motifs acide a-D galacturonique, plus ou moins substitués et unis par des liaisons a1-4. Leur solubilité varie avec leur sructure et dépend des conditions de pH et de température; leurs propriétés hydrocolloïdes expliquent leur responsabilité dans les difficultés d'extraction des jus de raisin et leur turbidité ainsi que les difficultés de filtration rencontrées.

L'élimination de ces composés soit par des "pectinases" endogènes, soit par les enzymes rajoutées est donc une nécessité du processus de vinification.

En vinification rouge classique, les mélanges enzymatiques commerciaux constitués de polygalacturonase de pectine estérase et de pectine lyase, produites par Aspergillus niger sont ajoutés lors de l'encuvage: l'extraction du jus et des pigments s'en trouve aisément facilitée. Dans les procédés de thermovinification, l'addition se fera après le traitement thermique. Lors de la vinification en blanc ou en rosé, l'addition d'enzymes se fait en sortie de pressoir, l'hydrolyse des pectines facilitant l'élimination des particules en suspension.

La préparation des jus de fruits consiste comme précédemment à extraire le suc cellulaire en entraînant tout ou partie des pigments et des arômes responsables des caractéristiques organoleptiques des produits. Selon les cas, pour répondre au goût du consommateur, certains jus devront être clarifiés (raisin, pomme) tandis qu'avec d'autres fruits, la maintenance d'un trouble est appréciée (orange, nectar). La clarification fait appel à des opérations enzymatiques; au contraire dans le cas inverse, les enzymes endogènes doivent être inhibées. Les jus sont ensuite stabilisés.

Pour certains fruits (cassis, framboise, fraise,...) l'aide à l'extraction est une nécessité, la teneur en pectines des fruits et leur nature donnant une pulpe semi-gélifiée dont il est difficile d'extraire le jus. L'addition d'enzymes pectinolytiques solubilise le gel et améliore aussi l'extraction des pigments des tissus épidermiques des fruits; le traitement facilite le pressurage et augmente le rendement en jus de 2 à 20%.

L'obtention de jus de fruits limpides (pomme, poire) ou la production de jus concentrés nécessite aussi l'élimination des pectines surtout de la fraction méthoxylée moins soluble. Celle-ci peut être obtenue par hydrolyse ou par déméthylation (pectinestérase) suivie de l'élimination de l'acide pectique sous forme de sel ou de complexe insoluble. Le recours aux pectinestérases -qui augmentent la solubilité des pectines par déméthylation- est à déconseiller dans la mesure où elles donnent naissance à de l'alcool méthylique à partir du méthoxyle.

Parfois, la stabilisation des jus troubles (jus d'agrumes) passe au contraire par l'inhibition des pectinestérases naturellement présentes. Le traitement thermique peut ne pas être suffisant et il est alors nécessaire d'utiliser pour stabiliser le trouble une polygalacturonase susceptible de dégrader les fractions pectiques déméthylées.

La préparation de nectars obtenus par broyage de la pulpe et homogénéisation est améliorée par l'utilisation de "macérases", mélanges enzymatiques riches en polygalacturonases et dépourvues de pectinestérase. L'hydrolyse spécifique et partielle des pectines de la lamelle moyenne contribue à la dissociation des cellules et à leur mise en suspension dans le jus visqueux.

Dans la préparation de jus de légumes (jus de carottes, cocktails mixtes, tomates + céleri + paprika) par liquéfaction des tissus, l'hydrolyse doit être plus importante pour permettre l'éclatement de la cellule et la libération du cytosol; elle est obtenue par l'utilisation de préparations enzymatiques contenant à la fois des enzymes pectinolytiques et cellulolytiques.

A coté de ces enzymes "aides technologiques", l'industrie des jus de fruits en utilise aussi d'autres, susceptibles d'améliorer les qualités organoleptiques de certains jus d'agrume qui renferment encore, malgré les efforts de la sélection variétale , des quantités importantes de naringine (rhamnosylglucose de trihydroflavonone) au goût amer caractéristique.

Le traitement de ces jus par la naringinase, mélange de rhamnosidase et de b-glucosidase (obtenue par exemple à partir d'Aspergillus niger) permet une désamérisation. Un procédé utilisant la naringinase fixée sur support de silice a été récemment développé.

Dans les produits végétaux, le succès d'une technologie enzymatique demeure lié à divers facteurs physico-chimiques du milieu, d'où la nécessité de mettre en place divers contrôles préalables pour s'assurer d'une bonne reproductibilité des opérations. Il est aisé de mentionner les principaux facteurs susceptibles d'inhiber ou d'intensifier un mécanisme enzymatique:

• la présence et la concentration des acides organiques (surtout les acides ascorbique et citrique) qui déterminent l'acidité du milieu;

• ces mêmes éléments agissent aussi de façon indirecte par des interactions avec les cations métalliques: oxydo-réduction, degré de disponibilité, etc. Selon la nature de l'enzyme, une modification de l'état du cation (fer, cuivre, mercure, etc.) et de son milieu d'utilisation peut modifier considérablement l'activité enzymatique;

• le taux d'oxygène dissous du milieu conditionne aussi, de façon importante, l'intensité des réactions enzymatiques, voulues ou fortuites.

Ces remarques ne peuvent échapper au monde industriel, les productions agricoles présentant inéluctablement une grande variabilité dans leur composition, principalement dans le domaine des éléments mineurs. Cette caractéristique, propre aux ressources agro-alimentaires, constitue souvent un obstacle à l'essor des opérations enzymatiques.

La transformation du muscle en viande repose très largement sur des mécanismes biochimiques qui, après la mort des animaux, modifient plus ou moins profondément la composition et la structure des muscles. Les réactions mises en jeu, essentiellement des hydrolyses, affectent les protéines myofibrillaires, les protéines du cytosquelette et de la membrane de la cellule musculaire mais peu les protéines du collagène. De la cinétique et de l'intensité de ces réactions dépend très largement la définition des qualités des viandes en tête desquelles se situent la tendreté.

Sur ce plan et malgré une maturation technologiquement bien conduite, une carcasse de boeuf renferme donc toujours autant de morceaux à cuisson lente (35% environ) que de morceaux à cuisson rapide.

Pour tenter de modifier ce rapport et satisfaire à la demande des consommateurs, la technologie se doit donc de réaliser les deux impératives: optimiser les réactions normalement catalysée par les enzymes endogènes et provoquer l'hydrolyse du collagène par l'apport d'enzymes exogènes.

En ce qui concerne ce deuxième aspect de la technologie faisant appel à l'utilisation de protéases exogènes, la papaïne est l'enzyme utilisée dans le monde. La complexité du problème a conduit à la mise au point de techniques d'utilisation sophistiquées ( injection de solution d'enzymes- soit naturelles, soit inhibées réversiblement- dans la veine jugulaire au moment de l'abattage (procédé Pro-ten), l'utilisation de formes de papaïne actives seulement entre 60 et 66°C. Ces pratiques ne sont pas autorisées en France.

Pour l'instant, aucune technique reposant sur l'utilisation de collagénases spécifiques n'a été mise en oeuvre à l'échelle industrielle. Des résultats expérimentaux intéressants utilisant des collagénases bactériennes ont été obtenu par différentes équipes ( Valin, 1985) mais n'ont pas fait l'objet d'un transfert vers l'industrie.

Pour ce qui concerne l'activation post-mortem des protéases endogènes, certains des mécanismes sont aujourd'hui connus; ainsi, lors du refroidissement des carcasses et par suite des différences entre les énergies d'activation des systèmes enzymatiques liés au métabolisme des ions Ca²⁺, on assiste à un relargage de ces ions dans le cytosol.

Selon la vitesse de cette libération et les taux atteints, les thiol protéases Ca²⁺ dépendantes (calpaïnes) présentes sont soit activées par autoprotéolyse, soit peut-être inhibées par un inhibiteur spécifique (l'interaction étant elle-même Ca²⁺ dépendante). Dés lors, on comprend que les traitements technologiques classiques (refroidissement) ou expérimentaux (stimulation électrique) doivent être appliqués avec beaucoup de rigueur pour arriver à l'optimisation recherchée.

Les protéases lysosomales sont actives pour des pH<6; l'hydrolyse de l'ATP d'un côté et l'accumulation d'acide lactique de l'autre contribuent aussi à créer un milieu favorable à l'expression de l'activité de ces protéases. Or, cette chute du pH est aussi contrôlée par la technologie de traitement des carcasses.

Dès lors, on comprend l'importance des conditions de maturation sur le développement des caractéristiques organoleptiques. D'un côté, une maturation bien conduite assure une tendreté de la fibre musculaire elle-même; de l'autre, la protéolyse est à l'origine d'oligopeptides, notamment de dipeptides comme l'ansérine et la carnosine, qui participent à la valeur gustative de la viande...ou du bouillon dans le cas de viandes bouillies.

Nous avons vu que les enzymes pouvaient être utilisés tour à tour pour produire une substance à valeur biologique et/ou industrielle intéressante, transformer un substrat et aider dans un processus industriel (favoriser la filtration, éliminer un composé susceptible d'interférer techniquement, ou indésirable du point de vue organoleptique. En fait, leur grande variété et leur spécificité les ont fait très tôt utiliser aussi dans le secteur de l'analyse et du contrôle, particulièrement lorsque l'hétérogénéité du milieu se prêtait mal à un résultat spécifique par voie chimique. Pendant longtemps cependant leurs utilisations dans les opérations de contrôle et de régulation des procédés industriels ont été limitées par suite de la lenteur des temps de réponse et aussi de la fragilité de l'enzyme elle-même. Le développement des nouvelles méthodes d'immobilisation et leur mise en application dans les "biocapteurs" devrait permettre à terme de contourner cette difficulté.

Ces biocapteurs enzymatiques sont constitués par l'association de 2 systèmes:

• Un système sensible, constitué d'une ou de plusieurs enzymes immobilisées, chargées d'assurer la reconnaissance spécifique d'une substance cible;

• Un système électronique chargé de traduire sous forme de signal électrique l'activité du premier système auquel il est intimement connecté.

Dés lors, la réponse obtenue étant proportionnelle à la quantité du produit "cible" présent, la quantification du phénomène s'avère chose aisée. On peut ainsi doser substrat et/ou cosubstrat, inhibiteur, activateur, cofacteur, etc.

Des revues détaillées ont déjà fait le point dans ce domaine.

L'avantage d'un tel dispositif est énorme; la possibilité des contrôles en temps réel des étapes clés d'une production (vin, bière, hydrolyse de l'amidon, coagulation du lait, etc.) permettra une optimisation en continu de la chaîne.

Dans le domaine de l'analyse des produits finis, des réalisations existent déjà aussi bien aux Etats-Unis qu'en Europe ou qu'au Japon. Certains dispositifs déjà commercialisés permettent de doser plusieurs composés, lactose, saccharose, lysine, acide glutamique, acide lactique, éthanol, avec des temps de réponse rapide. D'autres capteurs enzymatiques sont utilisés pour des vérifications de conformité rapides de certains produits (fraîcheur du poisson, quantité de lécithine additionnée dans certains produits, etc.).

Cette revue bibliographique avait pour but de faire le point sur les possibilités d'utilisations industrielles des enzymes dans les différents secteurs des I.A.A. Force est de constater que pour de multiples raisons, le développement de ces pratiques ne se fait à la vitesse de ce qui était annoncé voici une dizaine d'années, l'avènement de ces "outils" dans ce secteur étant obligé de prendre en compte à côté des difficultés techniques, des contraintes légales et socio-culturelles dues aux préoccupations de sécurité alimentaire.

Quoi qu'il en soit, le développement industriel, à terme, de la technologie enzymatique passera par celui de ces quatre composantes, à savoir:

• le développement de nouvelles enzymes;

• le développement de nouvelles techniques d'immobilisation et la mise en oeuvre de nouveaux réacteurs enzymatiques;

• l'innovation de nouveaux produits;

• le contrôle poussé de la matière première.

A côté des méthodes traditionnelles du "screening" enzymatique des micro-organismes connus ou nouvellement découverts, les recherches dans ce domaine verront l'émergence des techniques modernes visant à la création d'activités enzymatiques spécifiques:

• utilisation de milieux réactionnels non conventionnels (solvants, ions métalliques, etc.);

• création de super-protéines enzymatiques modifiées (soit chimiquement, soit par la formation d'anticorps catalytiques);

• optimisation structure-fonction par les techniques de l'ingénierie protéique.

A l'exception des lipases, la plupart des enzymes travaillent habituellement dans des solvants aqueux. Ceci est parfois un handicap quand, par exemple, la réaction produit des molécules d'eau (hydrolases travaillant dans le sens de la synthèse), aussi préfère-t-on dans ces cas travailler en solvant organique. Deux procédés mettant en oeuvre cette technique sont utilisés industriellement: l'un intéresse la synthèse d'insuline humaine à partir d'insuline de porc, l'autre la synthèse d'aspartame (Searle-Nutra-Sweet); dans ce cas, l'acétate d'éthyle s'avère être le meilleur solvant pour la synthèse d'aspartame par la thermolysine immobilisée.

Les travaux de Saraswathi et Keyes (1984), relatifs aux modifications de structure, entraînant une variation de la spécificité de substrat enzymatique, ouvrent une voie d'approche intéressante. Une enzyme dénaturée par traitement acide est ensuite traitée par un inhibiteur compétitif de l'activité recherchée qui "modèle" la structure de l'enzyme. L'enzyme "actif" est ensuite lié covalenciellement à un support puis le ligand "structurant" est éliminé par dialyse.

La modification chimique (transformation d'un résidu sérine en résidu cystéine par exemple) du site actif des enzymes a été aussi utilisée pour modifier la spécificité de plusieurs amylases (Hollo et al., 1982) ou même la spécificité de groupe de l'enzyme (synthèse de flavopapaïne par couplage d'une molécule de riboflavine plus ou moins modifiée de la cystéine 25 de la papaïne par exemple) (Kaiser et Radziejewski, 1985).

La synthèse d'anticorps catalytiques (abzymes) s'inscrit dans cette démarche; ils sont nés des progrès de l'immunologie d'une part et de la connaissance du mécanisme de la catalyse enzymatique de l'autre. Toute réaction enzymatique implique le passage par un état de transition au cours duquel l'enzyme présente vis-à-vis du substrat modifié une affinité élevée. D'après Pauling, une substance stable, mimant en structure spatiale et en charge le stade intermédiaire devrait se fixer très fortement à l'enzyme. Ces 20 dernières années de nombreuses substances, analogues de différents états de transition, ont été synthétisées. Elles devraient pouvoir servir d'antigène pour induire les anticorps capables de reconnaître le vrai stade de transition du substrat et donc présenter une activité catalytique élevée. Les travaux de Lerner et Tramontano (1988) et ceux de Janda et al. (1988) portant sur l'hydrolyse de la fonction amide ont ouverts la voie dans ce domaine.

A côté de leurs utilisations actuelles en génie médical et pharmaceutique, ces techniques constituent une des voies porteuses d'espoir pour la synthèse d'enzymes utilisables dans les industries agroalimentaires. Les techniques de clonage, d'amplification de l'expression, du contrôle des mécanismes d'excrétion extracellulaires ou de la synthèse d'enzymes hybrides portant en eux un "appendice" artificiel permettant leur purification devraient apporter dans les années à venir à ce secteur industriel le souffle qui lui fait encore défaut.

Demain, enfin, les techniques d'ingénierie des protéines ( par mutagénèse dirigée in vitro) devraient mettre à disposition des industries agroalimentaires les "super enzymes" présentant des propriétés catalytiques programmées ( pH et températures optimaux industriellement intéressants et stabilité à toute épreuve). Ce n'est pas à terme une vue utopique du secteur, les résultats obtenus concernant la thermostabilité du lysozyme (Perry et Wetzel, 1984) ou la stabilité à l'oxydation de la subtilisine (Estell et al., 1985) sont là pour nous laisser penser que le futur à déjà commencé.

Le développement du génie enzymatique dans les I.A.A. passe forcément par la réduction de la consommation d'enzyme. Les techniques d'immobilisation et les réacteurs enzymatiques conventionnels présentent souvent au plan de l'exploitation industrielle des inconvénients à la fois techniques et économiques. Dans ce secteur aussi, la recherche progresse. Citons par exemple la méthode à la méthode à la polyazetidine développée par Rhône-Poulenc (d'après les travaux de Calton et al. 1986) (elle permet d'immobiliser des fractions bactériennes présentant des activités enzymatiques sous forme de membranes, de tubes ou de fibres) ou la technique brevetée et développée par l'Institut Battelle qui consiste à "greffer" génétiquement un polypeptide riche en cystéine par exemple, sur une enzyme donnée afin de favoriser son immobilisation ultérieure.

L'évolution de la technologie des réacteurs devrait aussi permettre d'effacer leurs inconvénients actuels; les "bacs agités" ou les réacteurs à "lits fixes" seront remplacés par des réacteurs de nouvelle génération associant membranes actives et filtration tangentielle. Des réalisations pilotes existent déjà dans certains domaines (hydrolyse du lactose par le procédé Damrae, production des acides aminés par le procédé Degussa-Braunschweig, réacteur à colonne préssurisée de la firme Tanabe, pour la production de L-alanine par décarboxylation de l'acide L-aspartique (Furui et Yamashita, 1985; Takamatsu et al., 1982).

Le développement de ces nouvelles technologies est évidemment tributaire du succès de son transfert vers l'industrie. Bien qu'à l'heure actuelle, l'innovation dans ce domaine soit encore timide, des exemples intéressants à plusieurs titres existent.

A côté du procédé Novo permettant de récupérer après décoloration et solubilisation par protéolyse, l'hémoglobine du sang des animaux d'abattoirs ou de l'utilisation industrielle déjà évoquée de la sulphydryl oxydase pour le traitement du lait UHT, on peut citer aussi l'emploi astucieux d'une b-1,3/b-1,6 glucanase dans la fabrication du vin de Sauternes (Dubourdieu et al., 1981). La "pourriture noble" (Botrytis cinerea) produit en effet un polysaccharide (b-3 glucane) qui résiste à l'hydrolyse des enzymes comme les dextranases et les glucanases et qui constitue un frein aux opérations de clarification par filtration. L'opération d'hydrolyse s'avère doublement intéressante car elle permet de diminuer la charge en micro-organismes et, par là même, la quantité de SO₂ nécessaire à la conversion.

L'industrie de l'amidon innove encore. Ainsi, à côté des enzymes utilisés dans les processus traditionnels, la firme Tate et Lyle, exploitant un brevet de Daniel et Farmer (1981), a mis au point un ingénieux procédé d'immobilisation d'amyloglucosidase précipitée et coréticulée par l'acétone et le glutaraldéhyde sur du charbon animal. Cette forme enzymatique est caractérisé par une activité très importante, qui permet de saccharifier par exemple les effluents des colonnes de chromatographie utilisées dans le procédé de préparation du glucose à partir de l'amidon.

L'industrie des huiles alimentaires utilise aussi ce type de technologie enzymatique. Ainsi, le traitement enzymatique des graines broyées par des hydrolases spécifiques permet l'hydrolyse des srtuctures cellulaires et, par là, une meilleure extraction de l'huile. Parfois aussi des composés toxiques, acide phytique, gossipol, sont éliminés au cours de cette étape.

• Bater A.G. fabrique le Palatinit ou isomaltole, mélange de sucres alcools peu digestibles, mais aux propriétés sucrantes importantes, par hydrogénation de l'isomaltulose.

• De même, l'utilisation d'une nouvelle fructosyltransférase isolée de Bacillus subtilis permet-elle de préparer avec un haut rendement des disaccharides aux utilisations industrielles pouvant devenir intéressantes (galactofructose;, xylofructose).

• Dans le domaine de l'analyse et du contrôle, on doit aussi mentionner l'utilisation de xanthine oxydase immobilisée (Watanabe et al., 1984) pour la détermination de l'état de fraîcheur du poisson. L'hypoxanthine présente, issue de la dégradation secondaire de l'ATP, est oxydée en acide inosinique. La consommation d'oxygène, mesurée par électrode spécifique, est bien corrélée à la quantité d'hypoxanthine présente.

L'enzymologie industrielle a déjà conquis une place honorable dans les I.A.A. au cours des dernières décennies. Tout laisse présager qu'elle peut devenir une technologie de plus en plus employée dans divers secteurs du monde alimentaire et des industries de santé.

Son essor sera, en premier lieu, lié aux progrès du génie génétique et de l'ingénierie des protéines. Ainsi la "construction" de molécules enzymatiques comportant une partie active et spécifique et une fraction disponible pour d'éventuels aménagements de l'activité ou de sa mise en oeuvre permettra sans doute une véritable explosion des opérations industrielles réalisables par voie enzymatique.

Même les procédés traditionnels tireront avantage de cette stratégie. Par exemple, un renforcement de la spécificité des substituts microbiens de la présure apporterait une amélioration du rendement fromager et ferait sauter le "verrou" économique constitué par la limitation de production de la présure animale. A l'inverse, des glucosidases moins spécifiques permettraient une production accrue de glucose, par hydrolyse enzymatique de sous-produits végétaux glucidiques.

De façon plus immédiate, les opérations enzymatiques présentent des caractéristiques justifiant, dès maintenant, leur emploi industriel:

• En comparaison avec les catalyseurs chimiques, les enzymes agissant à faibles températures, leur utilisation se traduit inévitablement par des économies d'énergie thermique.

• La spécificité de leur action présente fréquemment divers avantages:

- elle permet d'atteindre un objectif parfaitement circonscrit, ce qui ne peut être réalisé avec des réactifs ne possédant pas un spectre d'action aussi étroit;

- elle évite les réactions dépassant l'objectif visé, l'apparition fortuite de produits secondaires et, d'une manière générale, elle évite ou réduit la nécessité d'opérations ultérieures de purification.

La multiplicité des opérations spécifiques pouvant être réalisées par voie enzymatique constitue un champ d'action qui demeure encore partiellement inexploité. Cette remarque s'applique tant aux industries alimentaires qu'à d'autres secteurs industriels: il est tout à fait sage de prétendre que leur spécificité ouvrira des possibilités révolutionnaires pour la production de molécules et de matériaux très éloignés de l'agro-alimentaire.

A l'heure actuelle, les enzymes ont encore contre elles leurs exigences très particulières et leur fragilité. C'est pourquoi, leur avenir industriel dépend de solutions qui seront trouvées pour renforcer leur stabilité et les rendre moins sensibles aux facteurs de l'environnement dans lequel elles travaillent.