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techniques d'étude des Listeria dans les aliments

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 La recherche ou le dénombrement des Listeria prend un relief particulier en raison d'épidémies soit rares mais qui font la une de l'actualité en raison de la mortalité qu'elles entraînent. Il semble utile de faire le point sur les techniques utilisées.

Listeria est à l'origine de listérioses, soit néonatales, soit concernant des malades plus ou moins immunodéprimés (par l'âge, les cancers, le diabète, l'éthylisme, les traitements immunosuppresseurs...).

Listeria est très répandue dans l'environnement, et peut être commensal de l'homme. Listeria monocytogenes, seul vrai pathogène, possède les caractéristiques suivantes :

• température de croissance comprise entre 2°C et 45°C. Temps de génération

  • de 13 h à 25 h à 4°C
  • de 5 h à 8 h entre 10 et 13°C
  • de 0,70 h à 35°C.

• -  pH : de 5,0 à 9,6
• - concentration en NaCl supportée : plus de 10 %
• - la pasteurisation détruit Listeria. (réduction logarithmique de 8 par action à 72°C durant 15 s.)
• -  la congélation semble sans effet.

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Texte réglementaire

Un texte récent concernent les Listeria. Il en existe peut être d'autres malheureusement non trouvés.

NOTE DE SERVICE DG.AL/SVHA/N 88/N°8026 du 10 février 1988

(non parue au JO, p 229 d'Hygiène alimentaire : Laits et produits laitiers)
Cette note définit les protocoles de contrôles officiels et d'autocontrôles à mettre en place pour la recherche des Listeria monocytogenes.

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Les milieux utilisés

enrichissement

L'enrichissement sélectif utilise le bouillon de Frazer. Interviennent comme inhibiteurs l'acide nalidixique, l'acriflavine, le chlorure de lithium et une concentration assez élevée de chlorure de sodium.

Deux enrichissements peuvent être faits :

• un enrichissement primaire au jour 0 avec 25 g dans 225 cm3 de bouillon soit une dilution au 1/10.
• un enrichissement secondaire au jour 1 avec 0,1 cm3 de bouillon d'enrichissement primaire dans 10 cm3 de bouillon soit une dilution au 1/100.

La composition de ce bouillon est la suivante :

composition

bouillon de Frazer

Composition pour 1 dm3 :

• polypeptone 10,0 g
• extrait de levure 5,0 g
• extrait de viande 5,0 g esculine 1,0 g
• citrate de fer III ammoniacal 0,5 g
• chlorure de lithium 3,0 g
• acide nalidixique 0,02 g
• acriflavine (chlorhydrate) 0,025 g
• chlorure de sodium 20,0 g
• hydrogénophosphate de sodium 9,6 g
• dihydrogénophosphate de potassium 1,3 g
• pH =7,1

Le citrate de fer III ammoniacal (ammonium-fer(III)-citrate) est ajouté après stérilisation. (10 cm3 par dm3 d'une solution à 50 g.dm-3)
Cet ajout ultérieur est fort curieux puisque de nombreux milieux, y compris ceux qui suivent, l'incluent directement dans la composition du milieu autoclavé …

mode opératoire

La prise d'essai de 25 g est placée dans 225 cm3 de bouillon de Frazer, puis incubée à 30°C durant 24 heures.

isolement

milieux d'isolement

Les milieux d'isolement utilisés contiennent de nombreux inhibiteurs pour éliminer un maximum des germes présents en grande quantité dans le produit initial. (fromage, viande, …). Ces inhibiteurs sont souvent des antibiotiques antibactériens ou antifongiques, ainsi que le chlorure de lithium et l'acriflavine

Gélose OXFORD-CURTIS

Composition finale pour 1 dm3 :

• mélange spécial de peptones 23,0 g
• amidon de maïs 1,0 g
• esculine 1,0 g
• citrate de fer III ammoniacal 0,50 g
• acriflavine chlorhydrate 0,005 g
• cefotetan 0,002 g
• colistine sulfate 0,02 g
• cycloheximide 0,4 g
• fosfomycine 0,01 g
• éthanol 5,0 mL
• chlorure de lithium 15,00 g
• chlorure de sodium 5,00 g
• agar 15,0 g
• pH = 7,2

Les composants thermosensibles sont ajoutés extemporanément sous forme d'un additif en solution eau/éthanol. Ce sont l'acriflavine, le cefotetan, la colistine , le cycloheximide, la fosfomycine. (en italique dans la composition)

Sur ce milieu les colonies de Listeria apparaissent au bout de 24 heures sous forme de colonies grises ou gris-verdâtre luisantes, de 1 mm de diamètre environ, entourées d'un halo brun-noir. Après 48 heures, le diamètre devient de 2 mm, les colonies sont incrustées dans la gélose et présentent une dépression centrale.

Le milieu OXFORD est le moins sélectif : d'autres bactéries comme certains Streptococcus ou certains Staphylococcus peuvent présenter des colonies proches de celles de Listeria.

Gélose PALCAM

Composition finale pour 1 dm3 :

• mélange spécial de peptones 23,0 g
• amidon de maïs 1,0 g
• glucose 0,50 g
• mannitol 10,0 g
• esculine 0,80 g
• citrate de fer III ammoniacal 0,50 g
• acriflavine chlorhydrate 0,005 g
• ceftazidime 0,02 g
• polymyxine B sulfate 0,01 g
• rouge de phénol 0,09 g
• chlorure de lithium 15,00 g
• chlorure de sodium 5,00 g
• agar 15,0 g
• pH = 7,2

Les composants thermosensibles sont ajoutés extemporanément sous forme d'un additif. Ce sont l'acriflavine, la ceftazidime, la polymyxine B .

Sur ce milieu les colonies de Listeria ont le même aspect que sur gélose OXFORD mais sont verdâtres.

Gélose Mox (Gélose OXFORD modifiée au moxalactam)

Composition finale pour 1 dm3 :

• gélose Columbia modifiée 38,1 g
• esculine 1,0 g
• citrate de fer III ammoniacal 0,50 g
• colistine 0,01 g
• moxalactam 0,02 g
• chlorure de lithium 15,00 g
• pH = 7,2

Le composant thermosensible est ajouté extemporanément sous forme d'un additif. C'est le moxalactam.

Sur ce milieu les colonies de Listeria ont le même aspect que sur gélose OXFORD.

isolement

Le 3° jour, soit après 24 heures d'incubation des bouillons d'enrichissement, quatre isolements sont réalisés :

• deux à partir du bouillon RV sur deux milieux sélectifs
• deux à partir du bouillon sélénite-cystine sur deux milieux sélectifs

Ils sont incubés à 35-37°C.

Le 4° jour, soit après 48 heures d'incubation des bouillons d'enrichissement, les opérations décrites ci-dessus sont répétées.

identification

milieux et galeries d'identification

milieu TSAYE

= bouillon Trypticase-Soja à l'extrait de levure

Composition pour 1 dm3 :

• trypticase 17,0 g
• Soytone 3,0 g
• extrait de levure 6,0 g
• chlorure de sodium 5,0 g
• agar 15 g
• pH = 7,3

Gélose au sang frais de mouton

La gélose de base est la gélose TSAYE additionnée de 7 % de sang de mouton défibriné.

Gélose mobilité (SIM)

Composition pour 1 dm3 :

• extrait de viande 3,0 g
• extrait de levure 6 g
• chlorure de sodium 5 g
• agar 4,5 g
• pH = 7,4

milieu pour les fermentations

Composition pour 1 dm3 :

• gélysate 10,0 g
• chlorure de sodium 5,0 g
• bromocrésol pourpre 0,02 g
• pH = 6,8

Les glucides testés sont : D-xylose, L-rhamnose, Glucose, Maltose et mannitol. Ils sont ajoutés :

• soit sous la forme de disques préimprégnés.
• soit sous la forme d'une solution de glucide à 5 % en eau distillée stérile et stérilisés par filtration à raison de 1 cm3 de solution de glucide pour 9 cm3 de milieu. (concentration finale du glucide : 0,5 %).

milieu pour la recherche de l'uréase

milieu Urée de Christensen

milieu pour la recherche de la 3-hydroxy-butanone (VP) et le test de RM

bouillon Clark et Lubs

milieu pour la recherche de la nitrate réductase

bouillon à l'extrait de viande et peptone additionné de 1 g par dm3 de nitrate de potassium.

identification culturale et biochimique

À partir des colonies suspectes (5 colonies s'il y en a plus de 5, toutes sinon), isoler sur gélose TSAYE. Incuber à 30°C ou à 37°C durant 24 h.
Les colonies de Listeria doivent présenter en transillumination oblique un aspect bleuâtre avec une surface granuleuse. Leur taille est de 1 mm. Elles sont translucides et non pigmentées.

Les colonies suspectes sont alors réisolées sur gélose Trypticase-Soja à l'extrait de levure puis incubées 24- à 48 heures à 30°C.

Au microscope, les Listeria doivent alors se présenter sous formes de bacilles minces courts, animés de mouvements rotatifs ou d'une mobilité en pirouettes. Cette mobilité peut être réduite ou nulle si l'incubation a été faite à 37°C. On comparera à une souche témoin et l'on réincubera à 30°C.

Les colonies typiques sont soumises au test de la catalase (qui doit être positive) et au Gram qui doit révéler des petits bacilles Gram positifs.

Toujours pour les colonies susceptibles d'être des Listeria, seront recherchés ou effectués :

• la recherche de la fermentation du D-Xylose, du L-Rhamnose, du Glucose, du mannitol, du maltose et de l'Esculine (durée d'incubation de 24 h à 7 jours),
• le test RM et le test du VP, en milieu de Clark et Lubs stérilisé de préférence par filtration
• l'étude de la réduction des nitrates, en bouillon nutritif à 1 g.dm-3 de nitrate de potassium
• la présence de l'uréase
• le Camp test, réalisé avec une souche de Staphylococcus aureus très b-hémolytique et une souche de Rhodococcus equi. Dans ce test, l'exaltation de la b-hémolyse facilite l'identification :
  • - de L. ivanovii sous forme d'une b-hémolyse en forme de pelle avec Rhodococcus
  • - de la b-hémolyse de Listeria monocytogenes et L. seeligeri.

Les résultats obtenus divergent entre la FDA (Food and Drug Administration et le LCHA (Laboratoire central d'hygiène alimentaire) comme le montre le tableau d'identification. A>CTUELLEMENT seul le camp test fait avec Rhodococcus equi est réalisé.

• certains de ces tests sont avantageusement remplacés par l'utilisation de galeries miniaturisées. (API-Listeria);
  Cette galerie utilise les tests suivants :
  • - DIM test breveté mais sans précision permettant de préciser la réaction mise en jeu … Il s'agit probablement de la mise en évidence d'enzymes par des substrats artificiels réagissant avec le réactif Zym B.
  • - ESC esculine (test classique)
  • - a-MAN : a-mannosidase (utilisant probablement un substrat de type ONPM)
    puis un ensemble de tests classiques d'utilisation de glucides ou dérivés mise en évidence par acidification éventuelle :
  • - DARL : D-Arabitol
  • -  XYL : D-Xylose
  • -  RHA : Rhamnose
  • -  MDG : a-méthyl-D-glucoside
  • -  RIB : Ribose
  • -  GIP : Glucose-1-Phosphate
  • -  TAG : D-Tagatose

identification immunologique

L'identification de l'antigène pariétal et de l'antigène flagellaire est réalisé par des laboratoires spécialisés (un par pays), ce sérogroupage étant délicat.

identification par les phages

Le lysotypage n'est pratiqué que par six laboratoires dans le monde …

pouvoir pathogène chez la souris

Il est étudié par inoculation intrapéritonéale de souris blanches de race suisse avec 0,1 cm3 de suspension concentrée de 1010 Listeria par cm3. Les souches pathogènes tuent en moins de 7 jours.

La suspension concentrée est obtenue par centrifugation de 20 cm3 de culture en bouillon Trypticase soja à l'extrait de levure, le culot étant remis en suspension dans 1 cm3 d'eau physiologique.

Techniques récentes

Les techniques modernes, sondes et PCR, peuvent être très précieuses dans la recherche des Listeria monocytogenes en raison de leur spécificité, de leur sensibilité et de leur rapidité.

PCR

La voie de la PCR semble prometteuse dans l'immédiat avec la découverte d'une sonde spécifique de Listeria monocytogenes, sonde correspondant au gène de la listériolysine O, cytotoxine de cette espèce responsable de la survie intracellulaire. Découverte à l'Institut Pasteur, cette sonde a été construite à partir d'un fragment de 651 paires de bases du gène. À partir de ce polynucléotide, un oligonucléotide de 18 paires de bases a été sélectionné comme amorce de la PCR. (voir La Recherche n°223)

Sondes

De la même façon, deux sondes DNA complémentaires de séquences du RNA ribosomial de Listeria .ou de Listeria monocytogenes. ont permis la mise au point de tests immunoenzymatiques conduisant à la détection dans les aliments, après enrichissement, de ces bactéries.

Dans la technique développé par la société Diagnostics Nouveaux alimentaires, le protocole est le suivant :

• - lyse de l'échantillon (aliquote du bouillon d'enrichissement ou suspension de colonie suspecte par exemple) pour libérer le RNA ribosomial
• -  hybridation avec la sonde de détection marquée par la fluorescéine et la sonde de capture possédant une séquence poly-A
• -  capture de l'hybride par un dispositif en plastique introduit dans le tube et porteur d'une séquence poly-T.
• - lavage
• - le dispositif est placé ensuite dans la solution contenant l'Ac antifluorescéine marqué avec un enzyme de type peroxydase. (Horse radish peroxidase)
• - lavage
• - le dispositif est placé alors dans la solution contenant les substrats.
• - une solution d'arrêt est ajoutée
• - lecture au spectrophotomètre

Cette technique est commercialisée pour Listeria , Listeria monocytogenes., Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Salmonella pour le contrôle alimentaire.

Immunoenzymologie

Comme pour de nombreux autres microorganismes ou leurs produits de sécrétion, TRANSIA commercialise un test immunoenzymatique de détection de Listeria.

La méthode est très classique : des anticorps monoclonaux anti-Listeria sensibilisent les puits d'une microplaque. L'échantillon (en général bouillon d'enrichissement) chauffé 20 min. à 100°C est ajouté. Après lavage, des anticorps monoclonaux couplés à un enzyme sont ajoutés. Un nouveau lavage précède la réaction enzymatique de mise en évidence du "sandwich" ainsi formé.

Immunocapture

AES laboratoire distribue un test, le ListerTest, basé sur l'immunocapture des Listeria puis l'identification des colonies par réplique suivie d'un immunomarquage. L'intérêt particulier de cette technique est la possibilité de numérer les Listeria, qui, d'après AES Laboratoires, peuvent être tolérées en faible nombre : 40 à 60 % des viandes hachées crues contiennent au moins 1 Listeria par g, la majorité en ayant moins de 100 par g.

La technique utilisée peut être décrite en deux étapes :

immunocapture

L'échantillon initial peut être préparé selon un protocole propre à chaque produit et selon la sensibilité désirée : il est en effet possible de centrifuger au préalable l'aliment afin de concentrer les microorganismes (lait) ou de filtrer le broyat (qui peut aussi être dégraissé) …

Elle est réalisée grâce à des billes magnétiques microscopiques porteuses d'Ac polyclonaux. Après incubation agitée de 2 heures, les billes sont récupérées par leurs propriétés magnétiques. Ainsi les Listeria de l'échantillon sont-elles entièrement captées, donc très concentrées, sur les billes (si la quantité relative de billes est suffisante).

Après lavage, les billes sont étalées sur une gélose sélective constituée d'un bouillon coeur-cervelle additionnée de chlorure de lithium, de ceftazidime et d'acide nalidixique.

identification immunologique des colonies

Immunoempreinte

Des colonies visibles étant développées à la surface des milieux incubés, une membrane de réplication est déposée sur la boîte, avec un repérage qui permettra le retour sur les bactéries. Après 10 min. de contact, la membrane est retirée et plongée dans un bain d'éthanol qui fixe les bactéries prélevées et les tue. Après lavage, des anticorps monoclonaux anti-Listeria sont ajoutés. Après un nouveau lavage, des anticorps anti-anticorps précédents et marqués par un enzyme sont ajoutés . L'addition du chromogène permettra la mise en évidence des Listeria sur la membrane : les colonies seront alors récupérées à partir de la gélose initiale.

Des témoins positifs et négatifs permettent de valider le test.

sensibilité, remarques

AES laboratoire note :

• - que le test est spécifique de Listeria au niveau du genre.
• - que la sensibilité est bonne (rendements de 50 à 150 % ?)
• - que le test est particulièrement rapide puisqu'il élimine l'étape de l'enrichissement en Listeria en bouillon, étape qui a de plus l'inconvénient d'interdire toute numération. Les durées annoncées sont de 3 heures le 1° jour, 3 heures le 2° jour (si le développement bactérien est suffisant en 24 h.) au lieu des trois jours minimum dans l'approche traditionnelle.

Conclusion

Des techniques moins classiques vont peut être améliorer la détection des Listeria. Il s'agit de l'utilisation de la PCR ou d'hybridation DNA-RNA directe qui nécessitent des sondes DNA, ou d'anticorps monoclonaux. Ils vont peut être amener la recherche des Listeria vers le dénombrement puisqu'il semblerait que la simple recherche soit souvent insuffisante pour affirmer le danger de la consommation d'un aliment. J'espère n'avoir pas oublié d'autres applications actuelles de cette recherche des Listeria dans les produits alimentaires. Il est certain aujourd'hui que d'autres viendront sur le marché rapidement et que des progrès de sensibilité importants seront réalisés, progrès qui risquent de renforcer les nécessités de la numération et de l'identification précise du ou des taxons compté.

Adresses utiles :

- pour le sérogroupage

Centre national de référence des Listeria, Professeur COURTIEU, Centre hospitalier régional de Nantes, laboratoire de bactériologie-virologie, immunologie-hygiène hospitalière, hôtel-dieu, place Alexis-Ricordeau, 44035 NANTES Cedex

- pour le lysotypage

Laboratoire des services vétérinaires d'Indre et Loire, 46 avenue Gustave Eiffel, 37023 TOURS Cedex.

- techniques particulières

• - AES Laboratoire Route de Dol BP 54 35270 COMBOURG Tel 99 73 11 55 Fax 99 73 15 89
• - TRANSIA-DIFFCHAMP SA 8 Rue Saint Jean de Dieu 69007 LYON Tel 72 73 03 81 Fax 72 73 43 44

Bibliographie

• La Recherche n°223
• Hygiène alimentaire : laits et produits laitiers (Direction des Journaux officiels 26 Rue Desaix 75727 PARIS Cedex 15)
• L'information du biotechnicien n°1 (Doin)
• Documents des laboratoires HUMEAU
• Documents de la DGCCRF

Bilan de l'analyse en vue de la recherche des Listeria