III) Les anthocyanes
III. 1) Présentation et structure
Les anthocyanes, molécules faisant partie de la famille des flavonoïdes et capables d'absorber la lumière visible, sont des pigments qui colorent les plantes en bleu, rouge, mauve, rose ou orange. [19-21] Leur présence dans les plantes est donc détectable à l'oeil nu. A l'origine de la couleur des fleurs, des fruits et des baies rouges ou bleues, elles sont généralement localisées dans les vacuoles des cellules épidermiques, qui sont de véritables poches remplies d'eau. [20,22,23] Si la coloration des fleurs et des fruits est leur rôle le plus connu, on trouve également les anthocyanes dans les racines, tiges, feuilles et graines. En automne, les couleurs caractéristiques des feuilles des arbres sont dues aux anthocyanes et aux carotènes qui ne sont plus masqués par la chlorophylle.
Les précurseurs de la biosynthèse des anthocyanes sont les flavan-3,4-cis-diol ou leucoanthocyanidines (schéma 5). [15,16,24,25] Cependant les mécanismes et enzymes impliqués dans cette biosynthèse ne sont à ce jour pas totalement connus. Le terme ultime est généralement une glycosylation en position 3 par des enzymes (flavonoïde (anthocyanidine/flavonol)-3-O-glucosyltransférase: FGT) permettant une remarquable stabilisation de la molécule. [15] L'aglycone de l'anthocyane, qui est aussi le chromophore, est appelé anthocyanidine. Les anthocyanes ont une structure de base commune, le cation flavylium ou 2-phényl-1-benzopyrilium (schéma 7).
Une liste exhaustive d'anthocyanidines (aglycones), parmi les plus importantes, est fournie dans le tableau 1.
| Nom | Nomenclature | 3 | 5 | 6 | 7 | 3' | 4' | 5' | couleur à pH<1 |
| Apigéninidine | Ap | H | OH | H | OH | H | OH | H | orange |
| Lutéolinidine | Lt | H | OH | H | OH | OH | OH | H | orange |
| Tricétinidine | Tr | H | OH | H | OH | OH | OH | OH | rouge |
| Pélargonidine | Pg | OH | OH | H | OH | OH | H | H | orange |
| Aurantinidine | Au | OH | OH | OH | OH | H | OH | H | orange |
| Cyanidine | Cy | OH | OH | H | OH | OH | OH | H | orange-rouge |
| 5-Méthyl cyanidine | 5MCy | OH | OMe | H | OH | OH | OH | H | orange-rouge |
| Péonidine | Pn | OH | OH | H | OH | OMe | OH | H | rouge |
| Rosinidine | Rs | OH | OH | H | OMe | OMe | OH | H | rouge |
| 6-Hydroxy cyanidine | 6OHCy | OH | OH | OH | OH | OH | OH | H | rouge |
| Delphinidine | Dp | OH | OH | H | OH | OH | OH | OH | violet |
| Pétunidine | Pt | OH | OH | H | OH | OMe | OH | OH | violet |
| Malvidine | Mv | OH | OH | H | OH | OMe | OH | OMe | violet |
| Pulchéllidine | Pl | OH | OMe | H | OH | OH | OH | OH | violet |
| Europinidine | Eu | OH | OMe | H | OH | OMe | OH | OH | violet |
| Capensinidine | Cp | OH | OMe | H | OH | OMe | OH | OMe | violet |
| Hirsutidine | Hs | OH | OH | H | OMe | OMe | OH | OMe | violet |
Les anthocyanes sont glycosylées le plus souvent en position 3 et 5, [29] les sucres les plus fréquents étant des monosaccharides (glucose, galactose, rhamnose et arabinose), des di- et trisaccharides formés par combinaison des monosaccharides précédents. Dans la nature, les anthocyanes hydroxylées en position 3 sont en règle générale toujours glycosylées (permettant une meilleure solubilité et stabilité de l'anthocyane) mis à part quelques 3-déoxyanthocyanes telles que l'apigéninidine (3-déoxypélargonidine), la lutéolinidine (3-déoxycyanidine) et la tricétinidine (3-déoxydelphinidine).
A leur tour, les sucres peuvent être acylés par l'acide cinnamique (4), para-coumarique (19), caféique (2), ferulique (20), sinapique (21) ou encore l'acide malonique (22) (schéma 8). [30] Un exemple de la complexité structurale des anthocyanes est donné par les ternatines A3 [31] et A1 [32] extraites des fleurs bleu-violet de Clitoria ternatea, d'un poids moléculaire de 1637 et 2107, identifiées par l'équipe du professeur Norio Saito. La ternatine A3 demeure jusqu'à présent l'une des anthocyanes les plus complexes connues à ce jour (schéma 9). D'autres exemples d'anthocyanes acylées peuvent être donnés à travers la série d'anthocyanes à chromophore cyanidine ou pélargonidine, respectivement extraites des fleurs violettes de Matthiola incana [33] (chlorure de 3-O-(6-O-(trans-caffeyl)-2-O-(2-O-(trans-synapyl)-b-D-xylopyranosyl-b-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-(malonyl)-b-D-glucopyranosyl) cyanidine C2, schéma 10) et des fleurs rouges-violettes de Pharbitis nil (schéma 11). [34,35] Dans la nature, tous les groupes hydroxyles d'une anthocyane ne sont pas glycosylés, un groupe hydroxyle libre étant nécessaire pour générer toutes les gammes de couleurs responsables de la pigmentation des fleurs et des fruits.
Comme tous les flavonoïdes, les anthocyanidines présentent une absorption caractéristique dans le domaine UV. [36] La forme cationique de l'anthocyanidine est caractérisée par deux bandes d'absorption, dont une bande intense dans le domaine du visible, caractéristique pour chacune d'entre elles. [19] Ce maximum d'absorption subit un effet bathochrome quand la polarité du solvant diminue (solvatochromie négative); par contre, on observe un effet hypsochrome quand les positions 3' et 5' sont méthoxylées ou glycosylées. Les sucres augmentent la solubilité et la stabilité des anthocyanes. La couleur de l'anthocyanidine, en milieu aqueux acide (jusqu'à pH 3), est déterminée par le degré d'hydroxylation du cycle B (voir tableau 1), qui produit un effet bathochrome (bleuissement). La méthylation des positions 3' et 5' produit un effet hypsochrome (vers la couleur orange), de même que la glycosylation de la position 3.
Malgré leur pouvoir colorant, les anthocyanes sont peu utilisées dans l'industrie alimentaire et cosmétique, et ceci du fait de leur instabilité (perte ou changement de couleur) vis-à-vis de facteurs physico-chimiques incontournables (lumière, température et pH), ainsi que de réactions avec le dioxyde de soufre utilisé comme agent conservateur des aliments, de leur faible solubilité dans l'eau et d'une possible précipitation d'anthocyanes sous forme de complexes avec les protéines.
L'effet de pH, mentionné précédemment, est le premier facteur agissant sur le changement de couleur d'une anthocyane donnée. La variation de structure de l'anthocyane en fonction du pH est une particularité de ces molécules. Les observations visuelles d'une solution aqueuse d'anthocyane montrent la forte coloration rouge d'une solution à pH très acide, coloration qui décroît quand le pH augmente vers la neutralité. Une solution neutre d'anthocyane fraîchement préparée est bleue mais se décolore rapidement. Ces changements de couleur sont dus à des équilibres chimiques entre différentes formes que peut prendre l'anthocyane. L'étude cinétique de ces équilibres par le professeur Brouillard a permis d'établir le mécanisme suivant: [37-39]
Le passage d'une forme à l'autre fait intervenir plusieurs types d'équilibres chimiques réversibles (schéma 12).
C'est une réaction réversible dépendant du pH pour laquelle la constante d'équilibre
K'h a été déterminée pour la première
fois en 1953 par Sondheimer [40]
dans le cas de la 3-O-b-D-glucopyranosyl pélargonidine. Des études
ont montré que la vitesse d'équilibration de la réaction
d'hydratation était 106 fois plus faible que les réactions
acido-basiques ou réactions de transfert de protons conduisant aux
tautomères prototropiques. [38]
Ces résultats indiquent que, quel que soit le pH, les tautomères
prototropiques (bases quinoniques AH) sont les premiers à se former
et à disparaître lors d'une expérience de saut de pH.
Il est très intéressant, afin de comprendre la réactivité
des anthocyanes avec l'eau, de comparer les constantes d'équilibre
globales d'hydratation K'
Les positions 2 et 4 de l'ion AH
Ce sont des équilibres acido-basiques, très rapides (temps
de relaxation de l'ordre de la microseconde), qui transforment la forme
colorée AH
La tautomérie cycle-chaîne transforme l'hémiacétal
BH
Les différentes couleurs produites par les anthocyanes dans le monde des plantes sont une preuve que la perte de couleur par hydratation du cation flavylium n'est pas définitive. Il y a deux raisons principales à cela:
La première est que l'ensemble des transformations
structurales des anthocyanes en solution aqueuse et notamment la réaction
d'hydratation sont toutes des équilibres.
La seconde est que les formes colorées et incolores
ont des propriétés suffisamment différentes pour que
des mécanismes de stabilisation de la couleur interviennent par complexation
sélective des formes colorées.
La pigmentation des plantes par les anthocyanes dépend de nombreux facteurs. Par exemple, seules les six anthocyanidines majeures (tableau 1) sont responsables de la gamme de couleur (orange au bleu) que l'on peut rencontrer au niveau des fleurs et peut-être au niveau des fruits. On peut également remarquer que deux fleurs contenant une même anthocyane peuvent avoir deux couleurs différentes (par exemple, le chlorure de cyanine est l'anthocyane majoritaire commune à la rose rouge et au bleuet bleu). Pour comprendre le mécanisme de coloration des plantes, il faut étudier, au niveau moléculaire, l'interaction entre les anthocyanes et les autres polyphénols vacuolaires, appelés copigments.
En 1931, Robinson et ses collaborateurs 47,48 furent parmi les premiers à observer "l'effet de copigmentation ", déjà noté par Willstäter et Zollinger [49] dès 1913, lors de l'addition de copigments incolores (flavones, flavonols, tanins...) à une solution décolorée d'anthocyanes à pH supérieur à 3. Plus récemment (1972), Asen et ses collaborateurs ont mesuré un déplacement bathochromique de 20 nm et une augmentation de 228% de l'absorbance au maximum d'absorption dans le visible pour un système composé de chlorure de cyanine (2 x 10-3 mol dm-3) et de rutine (6 x 10-3 mol dm-3) à pH= 3,32. [50]
Le phénomène est intramoléculaire si le copigment est lié de façon covalente au chromophore, intermoléculaire si l'interaction a lieu entre deux molécules libres. Elle dépend de nombreux facteurs physiques et chimiques tels que le pH, la nature du solvant, la température, la structure et la concentration de l'anthocyane et du copigment, ainsi que de la présence de sels métalliques. [48,51,52] Le pH est l'un des facteurs déterminants. La connaissance du pH dans les vacuoles des plantes a été nécessaire pour reproduire le phénomène avec des solutions modèles. Des mesures microspectrophotométriques effectuées par Asen et son équipe à l'aide d'indicateurs colorés ont permis de mesurer le pH dans les vacuoles des plantes. Celui-ci varie de 2,5 à 7,5 (domaine de pH où l'on observe une perte de couleur par réaction d'hydratation). [53] Il est intéressant de noter que les valeurs des constantes d'équilibre d'hydratation et de transfert de proton sont situées précisément dans ce domaine de pH.
Avec le pH, la copigmentation est l'un des facteurs impliqués dans la coloration des fleurs. Elle intensifie et stabilise la couleur dans des conditions de pH où l'anthocyane est quasiment incolore et elle consiste en une formation de complexes moléculaires à empilement vertical entre une molécule incolore, le copigment ayant une partie plane riche en électrons p, et les formes colorées de l'anthocyane (schéma 14). [54-59]
Contrairement aux formes incolores, les formes colorées AH et
AH
A pH fortement acide (pH inférieur à 1: absence du phénomène d'hydratation), la copigmentation se manifeste par un effet bathochrome généralement accompagné par un léger effet hypsochrome sur la bande d'absorption au maximum d'absorption dans le visible, indiquant que le coefficient d'extinction molaire du complexe est plus faible que celui du cation flavylium. Ceci s'apparente à ce que l'on peut observer généralement dans le cas d'empilement de molécules possédant un fort caractère aromatique.
Le copigment est choisi de façon à être soluble dans l'eau et avoir une moitié aromatique plane pouvant former un empilement vertical avec la partie plane de l'anthocyane. Le copigment de par sa nature est incolore et n'a aucune influence directe sur la valeur de l'absorbance. De nombreuses molécules naturelles présentes dans les plantes sont capables de jouer le rôle de copigments d'anthocyanes:les purines,les dérivés hydroxylés d'acides benzoïques et cinnamiques et surtout les flavones (la rutine par exemple) dont les structures, proches de celle des anthocyanes, permettent de bons contacts moléculaires. Avec un même copigment, l'effet de copigmentation varie selon l'anthocyane. L'effet augmente avec le degré de méthoxylation et de glycosylation de celle-ci. Par exemple, la malvine est plus fortement copigmentée que la cyanine. L'effet de copigmentation est dépendant de l'hydratation de l'anthocyane, car celle-ci est nécessaire et explique le phénomène. Comme les diglucosides s'hydratent plus largement que les monoglucosides, la copigmentation est plus intense pour les anthocyanes sous forme de 3,5-diglucosides que sous forme de monoglucosides. L'effet de copigmentation (qui est déduit de la mesure de la constante thermodynamique de copigmentation) dépend essentiellement de la nature du solvant, de la température, de la structure de l'anthocyane et du copigment et de l'acidité libre.
Depuis une dizaine d'années, les techniques d'extraction et de purification de plus en plus élaborées techniquement et permettant une extraction dans des conditions les plus douces possibles, ont permis l'accès à des anthocyanes acylées et malonylées de plus en plus complexes (schémas 9, 10 et 11) et extrêmement stables à des pH faiblement acides. La plupart de ces anthocyanes possèdent des résidus cinnamiques et/ou maloniques reliés à des saccharides flexibles pouvant jouer le rôle de "linkers" permettant un repliement de ces groupements acylés sur la partie plus ou moins plane du chromophore avec formation d'empilements stables (empilement de type "Sandwich") qui ont été mis en évidence par des techniques RMN 2D (NOESY). [60-62] La formation de tels complexes par copigmentation intramoléculaire protège le chromophore de la réaction d'hydratation de façon plus efficace que la copigmentation intermoléculaire. [63]
La position et la longueur du "spacer" (mono ou diglucoside) déterminent la force de la copigmentation. Ce lien oriente le copigment, qui interagit avec le chromphore en apportant le minimum de contraintes stériques. Les copigmentations inter- et intramoléculaires sont des phénomènes de même nature qui entrent en compétition dans le milieu vacuolaire. L'addition d'un copigment à une anthocyane polyacylée ne change généralement pas sa couleur. Par contre, une anthocyane monoacylée peut présenter avec un copigment un phénomène de copigmentation intermoléculaire, car l'ion flavylium reste accessible au copigment par l'une de ses faces libres. [21]
A forte concentration, les formes colorées des anthocyanes s'associent entre elles pour former des dimères non covalents par empilement hydrophobe vertical. [21,49] L'auto-association s'accompagne d'un léger déplacement de la bande d'absorption dans le visible vers les faibles longueurs d'onde (effet hypsochrome). Comme pour la copigmentation, les forces responsables de l'auto-association semblent de nature hydrophobe. [64] Ce phénomène, négligeable en solution aqueuse diluée, peut être considéré dans les milieux naturels où la concentration d'anthocyane peut atteindre, voire dépasser 10-2 mol dm-3. [65-68] L'auto-association peut entrer dans ce cas en compétition avec la copigmentation intermoléculaire. [69] En 1980, Goto et ses collaborateurs ont pu mettre en évidence l'auto-association des bases quinoniques dans des milieux neutres par des techniques de RMN 1D et de dichroïsme circulaire. Cette association s'effectue avec un déplacement hypsochromique important et un large effet Cotton en dichroïsme circulaire, permettant de conclure que l'auto-association pouvait être un phénomène non négligeable dans la stabilisation et la variation de la couleur in vivo.
Contrairement aux copigments polyphénoliques, les ions métalliques présents dans le milieu naturel des anthocyanes, semblent jouer un rôle mineur dans la stabilisation de la couleur, et peu de travaux ont été entrepris dans l'étude quantitative de la complexation d'ions métalliques fortement oxophiles comme Al3+ ou Fe3+ avec des anthocyanes à structure catéchol (chromophore cyanidine et delphinidine essentiellement). Cependant, plusieurs groupes ont postulé puis démontré que la couleur bleue rencontrée chez quelques fleurs pouvait être due à l'association ternaire anthocyane-copigment-métal.
En 1919, Shibata fut l'un des premiers à proposer la possibilité de formation de complexes magnésium-anthocyane, s'appuyant sur le fait que la couleur bleue était en contradiction avec le pH vacuolaire (pH de 2,5 à 7,5), la copigmentation donnant des colorations bleu-violet mais jamais de coloration bleue. [70]
En 1957, Hayashi, isola la première métalloanthocyane (la commélinine) des fleurs bleues de Commelina communis, qu'il décrivit comme l'association de coordination 1:4 d'un atome de magnésium, de deux anthocyanes (awobanine) et deux unités flavoniques (la flavocommeline). [71,72]
En 1958, Bayer isola une deuxième métalloanthocyane, la protocyanine isolée de Centaurea cyanus, qu'il décrivit comme l'association d'un ion métallique trivalent lié à deux molécules de cyanine et une molécule d'acide polygalacturonique (schéma 15). [73]
En 1986, Goto et Kondo ont proposé, par l'obtention d'une structure R X et par des études de dichroïsme circulaire, la structure définitive de la commélinine. [60,61,74] La formule de ce pigment est (M6F6Mg2)2-. Deux ions magnésium relient trois sous-unités dont chacune est formée par l'empilement non covalent de deux molécules d'anthocyanes acylées (la malonylawobanine M) encadrées par deux molécules de flavone (la flavocomméline F, schéma 16).
Les anthocyanes possédant deux groupements hydroxyles en position 3' et 4', c'est-à-dire les dérivés de la cyanine, de la delphinidine et de la pétunidine, sont capables de former des complexes par chélation d'ions métalliques à forte charge positive tels que Al3+ ou Mg2+. L'acidité remarquable du groupement hydroxyle en position 4' (pKa de l'ordre de 4) facilite le remplacement des deux protons du catéchol par un ion métallique se comportant comme un acide dur.
Ici encore, complexation métallique et hydratation sont en compétition. L'addition d'un ion métallique à une solution faiblement acide d'anthocyane entraîne un fort effet bathochrome qui, comme pour la copigmentation, traduit le déplacement de l'équilibre d'hydratation vers l'ion flavylium sélectivement complexé. La structure quinonique qu'adopte l'anthocyane dans le complexe permet d'expliquer le fort effet bathochrome (bleuissement) qu'entraîne la complexation métallique (schéma 17). [51,52]
Le photochromisme est un processus propre à quelques pigments ayant la particularité de former d'importantes quantités de chalcones CZ (dans le cas où il n'y a pas substitution en position 3 du chromophore; chalcone CE dans le cas contraire). Il consiste en une photoisomérisation des chalcones trans en chalcones cis, suivie d'une cyclisation rapide pour conduire à une structure de type pyrilium caractéristique du cation flavylium, et ceci dans une zone de pH où l'hydratation et l'isomérisation prédominent. Ce mécanisme est appelé photochromisme et caractérise quelques pigments naturels et plusieurs pigments synthétiques (fig. 1). C'est un équilibre dont la position va dépendre de la quantité de lumière ambiante. [52,75] En 1966, Jurd fut l'un des premiers à étudier ce type de réaction en exposant à la lumière du soleil des solutions équilibrées à pH = 5,6 de chlorure de 4',7-dihydroxyflavylium. [76]
A notre connaissance, aucun système chimique naturel ne possède cette particularité (évolution de la couleur en fonction de la lumière). Des résultats indiquant que le photochromisme se conserve en présence d'un copigment, d'un métal ou de macrocycles tels que les b-cyclodextrines permettent de penser que cette réaction photochimique pourrait jouer un rôle déterminant dans la variation de la couleur au niveau de systèmes naturels.
III. 5) Inclusion des anthocyanes dans les cyclodextrines
Avec les cyclodextrines (schéma 18), les anthocyanes ne se comportent
pas de la même manière qu'avec les copigments. Le phénomène
d'inclusion observable par spectroscopie UV-visible, est le plus sensible
à un pH où la forme colorée AH
Le degré de substitution des différents pigments intervient
également dans ce processus. Des études physico-chimiques,
effectuées dans le but de distinguer les différentes formes
incolores par leur aptitude à complexer la b-cyclodextrine, il apparaît
que c'est la Z-chalcone qui donne le complexe le plus stable. L'hydratation
du cation semble être deux fois plus rapide dans la cavité
macrocyclique et la b-cyclodextrine décuple l'isomérisation
de C
