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Séminaire présenté au sein de l'unité GEDE - UCL en décembre 2000

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v     Projet général :

 les protéines hedgehog dans le développement embryonnaire normal et anormal : implication du cholestérol

v   Originalité :  

o       Protéines  Hh impliquées dans le développement:membres >< S.N.C.

o       Etude de Ihh >< Shh 

o       Inhibiteur = triparanol >< AY9944 

v   Ici :  

o       Présentation       du projet

de la littérature

des premières mises au point

des difficultés rencontrées 

o       Approche différente axée sur les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol et les anomalies associées (DES Toxicologie)

v   Métabolisme du cholestérol 

o       A partir d’acétyl CoA (acétate en C2 activé) 

o       Dans le foie à 80% (+ intestin, corticosurrénale, gonades, peau, S.N) 

* épuration du cholestérol alimentaire

* synthèse du cholestérol endogène

v   Inhibition de la synthèse du cholestérol 

Ø    Proximale 

Enzyme clé = HMGCoA rédustase 

Inhibiteurs = mévastatine, lovastatine, simvastatine

Similitude au niveau de leur chaîne latérale

Inhibition spécifique & compétitive

­ synthèse des récepteurs aux LDL 

Ø     Distale 

o       Enzyme ciblée = 7 déhydrocholestérol D 7 réductase 

Inhibiteurs = AY9944 (= trans 1.4 bis 2 chlorobenzylaminométhyl cyclohexane)

inhibition compétitive du complexe intermédiaire de la D 7stérol réductase 

à ­ 7 déhydrocholestérol

¯ cholestérol sérique 

o        Enzyme ciblée = D 24 déhydrocholestérol réductase 

Inhibiteurs = Triparanol(= 4 chloro α 4,2 diéthylaminoéthoxyphényl α 4 méthyl phényl benzeéthanol) 

                                                1° hypocholestérolémiant commercialisé (années 60) 

inhibition de la réduction de la double liaison C24 

à ­ desmostérol

v   Importance du cholestérol chez les embryons 

Ø     Cholestérol endogène 

In vitro chez la souris : synthèse dès le stade préimplantatoire 

In vitro chez le rat : synthèse démontrée à  J 10-12 

In vivo dans les cellules embryonnaires : biosynthèse modulée  

              Selon               * les besoins de l’embryon

                                        * les apports exogènes 

Ø     Cholestérol exogène 

Transfert placentaire maternofoetal  (mécanismes moléculaires mal connus)

Essentiellement sous forme de HDL chez les rongeurs 

v   Syndrôme polymalformatif humain 

= Smith Lemli Opitz 

o       Déficit de 7 déhydrocholestérol D 7 réductase 

o       Syndrôme autosomique récessif souvent létal (1/20.000 à 1/40.000) 

o       Anomalies décrites : 

-         malformations craniofaciales et cérébrales 

(dysmorphie faciale, microcéphalie, anomalies oculaires, lésions dégénératives des neurones) 

-         malformations des membres et du squelette ( syndactilie, polydactilie postaxiale) 

-         malformations cardiaques 

-         retard de croissance 

-         anomalies uro-génitales 

-         anomalies du tractus gastro-intestinal 

v   Tératogenèse chez les rongeurs

Variation dans la sensibilité du tératogène selon l’animal (souris beaucoup moins sensible au triparanol que le rat)

            Exemples de malformations dues au triparanol : 

-         cyclophalie

-         cyclopie 

-         craniorachisis 

-         fentes palatines 

-         monorhinie

Récemment :  

observation d’anomalies du squelette ayant pour cible principale les membres  

(protocole de traitement  + tardif que précédemment pour le SNC) 

v   Objectif 

Ø    Modèle animal (en collaboration avec Paris) 

Traitement des rates gestantes avec un inhibiteur de la synthèse du cholestérol 

à malformations du S.N.C.

&

malformations des membres (récemment décrites)

Ø    Question 

Est-ce que ces anomalies des membres peuvent être expliquées par une perturbation de la fonction des protéines Hh ?

 (déjà démontré pour le lien entre malformations du S.N.C. et protéines Hh)

Ø    Choix 

Selon les courbes de stérols maternels (voir shéma) 

à on se focalise sur l’étude de Ihh plutôt que Shh (explications + loin)

v   Liens entre cholestérol et protéines hedgehog 

o       Montré pour une anomalie : l’holoprosencéphalie

= défaut du développement de la ligne ventro-médiane du prosencéphale 

Ø           Causes tératogènes : 

-         inhibiteurs distaux de la biosynthèse du cholestérol 

Ø           Causes génétiques : 

-         S.L.O. à 5% forme d’holoprosencéphalie 

-         Mutation de Shh (H.P.E. de type 3)

o       Protéine hedgehog de la drosophile (polarité de segment)

Chez les vertébrés : 3 gènes homologues : Shh, Ihh, Dhh 

Maturation post traductionnelle (protéolyse) couplée à l’addition de cholestérol 

-         attaque nucléophile de la triade catalytique

et réarrangement intramoléculaire du précurseur Shh 

-         formation d’un pont thioester intermédiaire

et attaque nucléophile du groupe hydroxyle du cholestérol 

-         clivage du précurseur et libération d’un fragment Shh-Np lié au cholestérol (portant l’activité biologique)

à SI absence de clivage et/ou cholestérol

à protéine non active 

o             au labo :   

malformations du S.N.C. (observés dans le modèle animal du S.L.O.) 

sont la conséquence de la perte ou la réduction du signal Shh au cours du développement  

(en relation directe  avec l’absence endogène de cholestérol) 

o       ici :  

fonction des protéines Hh dans les membres 

-         pattern d’expression :       Shh : assez tôt dans le développement 

                                                            dans la Zone d’Activation Polarisante

                                                            contrôle l’axe antéro-postérieur 

                                                            Ihh : + tard dans le développement 

                                                            dans les chondrocytes 

                                                            contrôle la différenciation du cartilage

                                                            (ossification endochondrale) 

-         K.O. ou expression ectopique : 

Shh : absence complète des doigts 

            fusion des os pairs (partie distale) 

Ihh : trouble du développement des os longs 

            défaut de maturation des chondrocytes

v   Projet

Ø     Hybridation in situ sur des membres d’embryons de rats exposés in utero  

au triparanol (même protocole que précédemment)  

avec une sonde d’ARN correspondant        au gène Ihh

&

aux gènes cibles Ptc et Gli. 

Ptc & Gli =       gènes cibles des voies de Shh & Ihh

mais aussi

protéines impliquées dans la cascade de signalisation 

o       Ptc : protéine à 12 domaines transmembranaires

liant spécifiquement Shh

et intervenant dans le processus de transmission du signal Hh 

o       Gli (1,2,3) : protéine à doigt de zinc relayant un signal d’induction ou de répression d’expression des gènes cibles de Hh

v   Méthodologie 

Ø     Traitement des rates avec du triparanol 

o       Accouplement : 7H30 à 9H30   (1 ♂dans 1 cage de 5 à 6 ♀) 

o       Pesée des rates à ajustement du volume exact à injecter 

o       Triparanol dissout dans de l’huile de tournesol rafinée Dose : 200 mg/ Kg 

o       Gavage à n’importe quel moment de la journée (J9 ou J10) avec une seringue avec canule à gaver 

o       Prélèvement des fœtus (J14 ou J15)

Ø     Hybridation in situ whole-mount 

o       Sonde ARN marquee à la digoxigénine 

o       Hybridation sur des membres d’embryons de rats 

à adaptation de la technique 

  perméabilisation : trouver un équilibre

                                                                        (fragilité  >< tissus cartilagineux) 

o       Hybridation soit sur membres isolés (ant. et post.)

à côtés droit & gauche hybridés avec 2 gènes différents

soit sur embryon

àcoupé en 2 longitudinalement 

v   Résultats préliminaires (dias)

Ø    Souris  

J 10,5  : Ihh 

J 11  : Ptc 

J 11,5 : Shh – Ihh – Ptc 

J 12,5 : Shh – Ihh – Ptc 

J 13,5 : Ihh – Ptc 

Ø     Rats

J 14 : Ihh – Ptc 

J 15 : Ihh – Ptc – Gli 

v   Problème avec Ihh 

Ø     Hybridation avec des sondes issues de gènes de souris 

Recherche précise dans la banque de données du pourcentage d’homologie (souris/rat) pour Ihh 

Mais peu probable car la sonde comprend quasi tout le gène (sauf le côté C-terminal)

Ø     Hybridation avec une sonde trop longue ? 

Or la taille de la sonde Ihh est semblable à celle de Gli1 (+/- 1.5 kb) qui elle donne un signal visible 

Mais l’expression de Gli dans le perichondrium est peut-être plus aisée que celle de Ihh (au sein des condensations cartilagineuses) 

à essais d’hydrolyse alcaline en cours

Ø     Exposition (révélation) de trop longue durée ? 

Marquage de la zone interdigitale et des condensations cartilagineuses proximales 

Mais on soupçonne que ce marquage = bruit de fond 

à synthèse de sonde sens en cours

Si vous avez des informations complémentaires sur le sujet, merci de m'en faire part...

Pow0@hotmail.com

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